Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível à espécie de oxigênio reativa
Summary
O presente protocolo descreve um método para detectar espécies reativas de oxigênio (ROS) nos organoides murinas intestinais utilizando imagens qualitativas e ensaios quantitativos de citometria. Este trabalho pode ser potencialmente estendido a outras sondas fluorescentes para testar o efeito de compostos selecionados em ROS.
Abstract
As espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham papéis essenciais na homeostase intestinal. Ros são subprodutos naturais do metabolismo celular. Eles são produzidos em resposta à infecção ou lesão no nível mucosa, pois estão envolvidos em respostas antimicrobianas e cicatrização de feridas. Eles também são mensageiros secundários críticos, regulando vários caminhos, incluindo crescimento celular e diferenciação. Por outro lado, os níveis excessivos de ROS levam ao estresse oxidativo, que pode ser deletério para as células e favorecer doenças intestinais como inflamação crônica ou câncer. Este trabalho fornece um método simples para detectar ROS nos organoides murina intestinais por imagem viva e citometria de fluxo, usando uma sonda fluorogênica comercialmente disponível. Aqui o protocolo descreve o ensaio do efeito de compostos que modulam o equilíbrio redox em organoides intestinais e detectam níveis de ROS em tipos específicos de células intestinais, exemplificados aqui pela análise das células-tronco intestinais geneticamente rotuladas com GFP. Este protocolo pode ser usado com outras sondas fluorescentes.
Introduction
Espécies reativas de oxigênio (ROS) são subprodutos naturais do metabolismo celular. Eles também podem ser produzidos ativamente por complexos enzimáticos especializados, como os NADPH-Oxidases (NOX) e Dual Oxidases (DUOX), que geram ânion de superóxido e peróxido de hidrogênio1. Ao expressar enzimas antioxidantes e catadores ros, as células podem ajustar finamente seu equilíbrio redox, protegendo assim a homeostase tecidual2. Embora o ROS possa ser altamente tóxico para as células e danificar DNA, proteínas e lipídios, eles são moléculas de sinalização cruciais2. No epitélio intestinal, são necessários níveis de ROS moderados para a proliferação de células-tronco e progenitoras3; altos níveis de ROS levam à sua apoptose4. O estresse oxidativo crônico está ligado a muitas doenças gastrointestinais, como doenças inflamatórias intestinais ou câncer. Como exemplo, em um modelo de camundongo de câncer intestinal orientado por Wnt, a produção elevada de ROS através da ativação de NADPH-oxidases foi considerada necessária para as células cancerosas hiperproliferation5,6. Definir como as células intestinais, em particular as células-tronco, as células-tronco gerenciam o estresse oxidativo e como o ambiente celular pode impactar essa capacidade é essencial para entender melhor a etiologia dessa doença7.
Em um tecido, diferentes tipos celulares apresentam um estado oxidativo basal que pode variar de acordo com sua função e metabolismo e a expressão de diferentes níveis de moléculas oxidantes e antioxidantes4,7. Monitorar a ROS in vivo é muito desafiador. Corantes permeáveis celulares que emitem fluorescência de acordo com seu estado redox foram desenvolvidos para visualizar e medir ros celular em células vivas e animais. No entanto, sua eficácia depende de sua difusão dentro de tecidos vivos e sua leitura rápida, tornando-os difíceis de usar em modelos animais8.
No passado, o estudo do efeito dos compostos na geração ROS foi feito utilizando linhas celulares, mas isso pode não refletir a situação in vivo . O modelo organoide intestinal, desenvolvido pelo grupo de Clevers9, permite o crescimento de células primárias intestinais ex vivo. A cultura de criptas intestinais em matrizes, na presença de fatores de crescimento definidos, leva a estruturas tridimensionais, chamadas organoides (mini-intestino), que reproduzem a organização cript-villus, com células das diferentes linhagens epiteliais que revestem um lúmen interno, e as células-tronco intestinais residentes em pequenas saliências como criptas.
Aqui, aproveitando este modelo, um método simples é descrito para estudar o estresse oxidativo em células intestinais primárias na resolução unicelular, adicionando um corante sensível a ROS comercialmente disponível no meio da cultura organoide.
Leitores de placas são frequentemente usados para detectar a produção de ROS em uma população total. Este protocolo usa citometria de fluxo ou ensaio de imagem para detectar ROS em um determinado tipo de célula com células geneticamente modificadas ou coloração específica de anticorpos. Este trabalho envolve a cultura organoide intestinal do camundongo e a visualização ros por imagem confocal e quantificação por citometria de fluxo. Usando organoides intestinais pequenos derivados de camundongos LGR5-GFP, é possível analisar especificamente o nível de estresse oxidativo em células-tronco intestinais em diferentes tratamentos. Este protocolo pode ser adaptado para testar a influência de moléculas exógenas, como o muramyl-dipeptida derivado da microbiota (MDP)10, no equilíbrio ROS, após estimular organoides com os compostos selecionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho fornece um protocolo passo-a-passo para isolar criptas jejunal murinas, cultuá-las em organoides 3D e analisar ROS em organoides, combinando uma sonda fluorogênica sensível à ROS com imagens de microscopia qualitativa de organoides inteiros e medição quantitativa de ROS usando citometria de fluxo em células únicas após a dissooididade organoidativa.
O primeiro passo crítico neste método é o procedimento de extração de criptas. De fato, a qualidade da preparação da…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
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