تحليل الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية المعوية الفئرانية باستخدام مسبار الفلوروجينيك الحساس لأنواع الأكسجين التفاعلية
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة للكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في عضويات الفئران المعوية باستخدام التصوير النوعي ومقايسات قياس الخلايا الكمية. يمكن توسيع هذا العمل ليشمل مجسات الفلورسنت الأخرى لاختبار تأثير المركبات المختارة على ROS.
Abstract
تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أدوارا أساسية في التوازن المعوي. ROS هي منتجات ثانوية طبيعية لعملية التمثيل الغذائي للخلايا. يتم إنتاجها استجابة للعدوى أو الإصابة على مستوى الغشاء المخاطي لأنها تشارك في الاستجابات المضادة للميكروبات والتئام الجروح. كما أنها رسل ثانويون مهمون ، ينظمون العديد من المسارات ، بما في ذلك نمو الخلايا والتمايز. من ناحية أخرى ، تؤدي مستويات ROS المفرطة إلى الإجهاد التأكسدي ، والذي يمكن أن يكون ضارا بالخلايا ويفضل الأمراض المعوية مثل الالتهاب المزمن أو السرطان. يوفر هذا العمل طريقة مباشرة للكشف عن ROS في عضويات الفئران المعوية عن طريق التصوير الحي وقياس التدفق الخلوي ، باستخدام مسبار فلوروجيني متاح تجاريا. هنا يصف البروتوكول فحص تأثير المركبات التي تعدل توازن الأكسدة والاختزال في المواد العضوية المعوية وتكشف عن مستويات ROS في أنواع محددة من الخلايا المعوية ، ويتضح هنا من خلال تحليل الخلايا الجذعية المعوية المصنفة وراثيا مع GFP. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع مجسات الفلورسنت الأخرى.
Introduction
أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي منتجات ثانوية طبيعية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. كما يمكن إنتاجها بنشاط بواسطة مجمعات إنزيمية متخصصة مثل NADPH-Oxidases المرتبط بالغشاء (NOX) و Dual Oxidases (DUOX) ، والتي تولد أنيون فائق الأكسيد وبيروكسيد الهيدروجين 1. من خلال التعبير عن الإنزيمات المضادة للأكسدة وكاسحات ROS ، يمكن للخلايا ضبط توازن الأكسدة والاختزال بدقة ، وبالتالي حماية توازن الأنسجة 2. على الرغم من أن ROS يمكن أن يكون شديد السمية للخلايا ويتلف الحمض النووي والبروتينات والدهون ، إلا أنها جزيئات إشارة حاسمة2. في الظهارة المعوية ، هناك حاجة إلى مستويات ROS معتدلة لانتشار الخلايا الجذعية والسلف 3 ؛ مستويات ROS العالية تؤدي إلى موت الخلايا المبرمج 4. يرتبط الإجهاد التأكسدي المزمن بالعديد من أمراض الجهاز الهضمي ، مثل أمراض الأمعاء الالتهابية أو السرطان. على سبيل المثال ، في نموذج الفأر لسرطان الأمعاء الذي يحركه Wnt ، وجد أن إنتاج ROS المرتفع من خلال تنشيط NADPH-oxidases مطلوب لفرط انتشار الخلايا السرطانية5,6. إن تحديد كيفية إدارة الخلايا المعوية، وخاصة الخلايا الجذعية، والخلايا الجذعية للإجهاد التأكسدي وكيف يمكن للبيئة الخلوية أن تؤثر على هذه القدرة أمر ضروري لفهم مسببات هذا المرض بشكل أفضل7.
في الأنسجة ، تقدم أنواع الخلايا المختلفة حالة أكسدة قاعدية قد تختلف وفقا لوظيفتها والتمثيل الغذائي والتعبير عن مستويات متفاوتة من جزيئات المؤكسدة ومضادات الأكسدة4,7. مراقبة ROS في الجسم الحي أمر صعب للغاية. تم تطوير أصباغ نفاذية للخلايا تنبعث منها التألق وفقا لحالة الأكسدة والاختزال الخاصة بها لتصور وقياس ROS الخلوي في الخلايا الحية والحيوانات. ومع ذلك، تعتمد فعاليتها على انتشارها داخل الأنسجة الحية وقراءتها السريعة، مما يجعل من الصعب استخدامها في النماذج الحيوانية8.
في الماضي ، تم إجراء دراسة تأثير المركبات على توليد ROS باستخدام خطوط الخلايا ، ولكن هذا قد لا يعكس الوضع في الجسم الحي . النموذج العضوي المعوي ، الذي طورته مجموعة Clevers9 ، يمكن من نمو الخلايا الأولية المعوية خارج الجسم الحي. تؤدي زراعة الخبايا المعوية في المصفوفات ، في وجود عوامل نمو محددة ، إلى هياكل ثلاثية الأبعاد ، تسمى المواد العضوية (الأمعاء الصغيرة) ، والتي تعيد إنتاج تنظيم الزغابات ، مع خلايا من سلالات ظهارية مختلفة تبطن تجويفا داخليا ، والخلايا الجذعية المعوية الموجودة في نتوءات صغيرة تشبه الخبايا.
هنا ، بالاستفادة من هذا النموذج ، يتم وصف طريقة بسيطة لدراسة الإجهاد التأكسدي في الخلايا المعوية الأولية بدقة خلية واحدة عن طريق إضافة صبغة حساسة ل ROS متاحة تجاريا إلى وسط الثقافة العضوية.
غالبا ما تستخدم قارئات اللوحات للكشف عن إنتاج ROS في إجمالي عدد السكان. يستخدم هذا البروتوكول قياس التدفق الخلوي أو فحص التصوير للكشف عن ROS في نوع معين من الخلايا مع خلايا معدلة وراثيا أو تلطيخ معين للأجسام المضادة. يتضمن هذا العمل زراعة الأعضاء المعوية للفئران وتصور ROS عن طريق التصوير البؤري والقياس الكمي عن طريق قياس التدفق الخلوي. باستخدام Lgr5-GFP من الفئران العضوية المعوية الصغيرة المشتقة ، من الممكن تحليل مستوى الإجهاد التأكسدي في الخلايا الجذعية المعوية على وجه التحديد بناء على علاجات مختلفة. يمكن تكييف هذا البروتوكول لاختبار تأثير الجزيئات الخارجية ، مثل موراميل ثنائي الببتيد المشتق من الميكروبات (MDP)10 ، على توازن ROS ، بعد تحفيز المواد العضوية مع المركبات المختارة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا العمل بروتوكولا خطوة بخطوة لعزل سراديب الفئران الصولجان ، وزراعتها في عضويات 3D ، وتحليل ROS في المواد العضوية من خلال الجمع بين مسبار فلوروجيني حساس ل ROS مع تصوير مجهري نوعي للعضويات الكاملة وقياس ROS الكمي باستخدام قياس التدفق الخلوي على الخلايا المفردة بعد التفكك العضوي.
<p class="jov…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منحة الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR) 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
