Den nåværende protokollen beskriver en metode for å oppdage reaktive oksygenarter (ROS) i tarm murin organoider ved hjelp av kvalitativ avbildning og kvantitative cytometrianalyser. Dette arbeidet kan potensielt utvides til andre fluorescerende sonder for å teste effekten av utvalgte forbindelser på ROS.
Reaktive oksygenarter (ROS) spiller viktige roller i intestinal homeostase. ROS er naturlige biprodukter av cellemetabolisme. De produseres som respons på infeksjon eller skade på slimhinnenivå, da de er involvert i antimikrobielle responser og sårheling. De er også kritiske sekundære budbringere, som regulerer flere veier, inkludert cellevekst og differensiering. På den annen side fører overdreven ROS-nivåer til oksidativt stress, noe som kan være skadelig for celler og favorisere tarmsykdommer som kronisk betennelse eller kreft. Dette arbeidet gir en enkel metode for å oppdage ROS i tarm murin organoider ved levende avbildning og strømning cytometri, ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig fluorogen sonde. Her beskriver protokollen analysen av effekten av forbindelser som modulerer redoksbalansen i tarmorganoider og oppdager ROS-nivåer i spesifikke tarmcelletyper, eksemplifisert her ved analyse av tarmstammecellene genetisk merket med GFP. Denne protokollen kan brukes med andre fluorescerende sonder.
Reaktive oksygenarter (ROS) er naturlige biprodukter av cellulær metabolisme. De kan også produseres aktivt av spesialiserte enzymatiske komplekser som membranbundet NADPH-Oxidases (NOX) og Dual Oxidases (DUOX), som genererer superoksid anion og hydrogenperoksid1. Ved å uttrykke antioksidantenzymer og ROS-scavengers, kan cellene finjustere sin redoksbalanse, og dermed beskytte vev homeostase2. Selv om ROS kan være svært giftig for cellene og skade DNA, proteiner og lipider, er de avgjørende signalmolekyler2. I tarmepitelet er det nødvendig med moderate ROS-nivåer for stam- og stamcelleproliferasjon3; høye ROS-nivåer fører til apoptose4. Kronisk oksidativt stress er knyttet til mange gastrointestinale sykdommer, som inflammatoriske tarmsykdommer eller kreft. Som et eksempel, i en musemodell av Wnt-drevet tarmkreft, ble forhøyet ROS-produksjon gjennom aktivering av NADPH-oksider funnet å være nødvendig for kreftceller hyperproliferasjon5,6. Å definere hvordan tarmceller, spesielt stamceller, styrer oksidativt stress og hvordan det cellulære miljøet kan påvirke denne kapasiteten, er avgjørende for å forstå etiologien til denne sykdommen bedre7.
I et vev presenterer forskjellige celletyper en basal oksidativ tilstand som kan variere i henhold til deres funksjon og metabolisme og uttrykket av forskjellige nivåer av oksidant- og antioksidantmolekyler4,7. Overvåking av ROS in vivo er veldig utfordrende. Cellegjennomtrengelige fargestoffer som avgir fluorescens i henhold til deres redokstilstand, er utviklet for å visualisere og måle cellulær ROS i levende celler og dyr. Imidlertid avhenger deres effekt av deres diffusjon inne i levende vev og deres raske avlesning, noe som gjør dem vanskelige å bruke i dyremodeller8.
Tidligere ble studien av effekten av forbindelser på ROS-generering gjort ved hjelp av cellelinjer, men dette gjenspeiler kanskje ikke in vivo-situasjonen . Den intestinale organoidmodellen, utviklet av gruppen Clevers9, muliggjør veksten av intestinale primære celler ex vivo. Kultur av tarmkrypter i matriser, i nærvær av definerte vekstfaktorer, fører til tredimensjonale strukturer, kalt organoider (mini-gut), som reproduserer krypt-villus-organisasjonen, med celler fra de forskjellige epiteliale avstamningene som foringer en intern lumen, og tarmstammecellene som ligger i små krypterlignende fremspring.
Her, ved å dra nytte av denne modellen, beskrives en enkel metode for å studere oksidativt stress i primære tarmceller ved encellet oppløsning ved å legge til et kommersielt tilgjengelig ROS-sensitivt fargestoff i organoidkulturmediet.
Platelesere brukes ofte til å oppdage ROS-produksjon i en total befolkning. Denne protokollen bruker strømningscytometri eller bildeanalyse for å oppdage ROS i en bestemt celletype med genetisk modifiserte celler eller spesifikk antistofffarging. Dette arbeidet innebærer mus intestinal organoid kultur og ROS visualisering ved konfikal avbildning og kvantifisering ved strømning cytometri. Ved hjelp av Lgr5-GFP mus-avledede små intestinale organoider, er det mulig å spesifikt analysere nivået av oksidativt stress i tarmstammeceller ved forskjellige behandlinger. Denne protokollen kan tilpasses for å teste påvirkningen av eksogene molekyler, for eksempel mikrobiota-avledet muramyl-dipeptid (MDP)10, på ROS-balansen, etter å ha stimulert organoider med de valgte forbindelsene.
Dette arbeidet gir en trinnvis protokoll for å isolere murine jejunale krypter, dyrke dem i 3D-organoider og analysere ROS i organoider ved å kombinere en ROS-sensitiv fluorogen sonde med kvalitativ mikroskopiavbildning av hele organoider og kvantitativ ROS-måling ved hjelp av strømningscytometri på enkeltceller etter organoid dissosiasjon.
Det første kritiske trinnet i denne metoden er krypteruttrekkingsprosedyren. Faktisk er kvaliteten på krypterpreparat nøkkelen til vellykket organo…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av French National Research Agency (ANR) grant 17-CE14-0022 (i-Stress).
Mice | |||
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
Growth culture medium | |||
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
Material | |||
70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
96-well round bottom | Corning | 3799 | |
ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
Programs and Equipment | |||
Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
Prism | GraphPad Software | statistical analysis |