Analysere oksidativt stress i murine intestinale organoider ved hjelp av reaktive oksygenarter-sensitiv fluorogen sonde
Summary
Den nåværende protokollen beskriver en metode for å oppdage reaktive oksygenarter (ROS) i tarm murin organoider ved hjelp av kvalitativ avbildning og kvantitative cytometrianalyser. Dette arbeidet kan potensielt utvides til andre fluorescerende sonder for å teste effekten av utvalgte forbindelser på ROS.
Abstract
Reaktive oksygenarter (ROS) spiller viktige roller i intestinal homeostase. ROS er naturlige biprodukter av cellemetabolisme. De produseres som respons på infeksjon eller skade på slimhinnenivå, da de er involvert i antimikrobielle responser og sårheling. De er også kritiske sekundære budbringere, som regulerer flere veier, inkludert cellevekst og differensiering. På den annen side fører overdreven ROS-nivåer til oksidativt stress, noe som kan være skadelig for celler og favorisere tarmsykdommer som kronisk betennelse eller kreft. Dette arbeidet gir en enkel metode for å oppdage ROS i tarm murin organoider ved levende avbildning og strømning cytometri, ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig fluorogen sonde. Her beskriver protokollen analysen av effekten av forbindelser som modulerer redoksbalansen i tarmorganoider og oppdager ROS-nivåer i spesifikke tarmcelletyper, eksemplifisert her ved analyse av tarmstammecellene genetisk merket med GFP. Denne protokollen kan brukes med andre fluorescerende sonder.
Introduction
Reaktive oksygenarter (ROS) er naturlige biprodukter av cellulær metabolisme. De kan også produseres aktivt av spesialiserte enzymatiske komplekser som membranbundet NADPH-Oxidases (NOX) og Dual Oxidases (DUOX), som genererer superoksid anion og hydrogenperoksid1. Ved å uttrykke antioksidantenzymer og ROS-scavengers, kan cellene finjustere sin redoksbalanse, og dermed beskytte vev homeostase2. Selv om ROS kan være svært giftig for cellene og skade DNA, proteiner og lipider, er de avgjørende signalmolekyler2. I tarmepitelet er det nødvendig med moderate ROS-nivåer for stam- og stamcelleproliferasjon3; høye ROS-nivåer fører til apoptose4. Kronisk oksidativt stress er knyttet til mange gastrointestinale sykdommer, som inflammatoriske tarmsykdommer eller kreft. Som et eksempel, i en musemodell av Wnt-drevet tarmkreft, ble forhøyet ROS-produksjon gjennom aktivering av NADPH-oksider funnet å være nødvendig for kreftceller hyperproliferasjon5,6. Å definere hvordan tarmceller, spesielt stamceller, styrer oksidativt stress og hvordan det cellulære miljøet kan påvirke denne kapasiteten, er avgjørende for å forstå etiologien til denne sykdommen bedre7.
I et vev presenterer forskjellige celletyper en basal oksidativ tilstand som kan variere i henhold til deres funksjon og metabolisme og uttrykket av forskjellige nivåer av oksidant- og antioksidantmolekyler4,7. Overvåking av ROS in vivo er veldig utfordrende. Cellegjennomtrengelige fargestoffer som avgir fluorescens i henhold til deres redokstilstand, er utviklet for å visualisere og måle cellulær ROS i levende celler og dyr. Imidlertid avhenger deres effekt av deres diffusjon inne i levende vev og deres raske avlesning, noe som gjør dem vanskelige å bruke i dyremodeller8.
Tidligere ble studien av effekten av forbindelser på ROS-generering gjort ved hjelp av cellelinjer, men dette gjenspeiler kanskje ikke in vivo-situasjonen . Den intestinale organoidmodellen, utviklet av gruppen Clevers9, muliggjør veksten av intestinale primære celler ex vivo. Kultur av tarmkrypter i matriser, i nærvær av definerte vekstfaktorer, fører til tredimensjonale strukturer, kalt organoider (mini-gut), som reproduserer krypt-villus-organisasjonen, med celler fra de forskjellige epiteliale avstamningene som foringer en intern lumen, og tarmstammecellene som ligger i små krypterlignende fremspring.
Her, ved å dra nytte av denne modellen, beskrives en enkel metode for å studere oksidativt stress i primære tarmceller ved encellet oppløsning ved å legge til et kommersielt tilgjengelig ROS-sensitivt fargestoff i organoidkulturmediet.
Platelesere brukes ofte til å oppdage ROS-produksjon i en total befolkning. Denne protokollen bruker strømningscytometri eller bildeanalyse for å oppdage ROS i en bestemt celletype med genetisk modifiserte celler eller spesifikk antistofffarging. Dette arbeidet innebærer mus intestinal organoid kultur og ROS visualisering ved konfikal avbildning og kvantifisering ved strømning cytometri. Ved hjelp av Lgr5-GFP mus-avledede små intestinale organoider, er det mulig å spesifikt analysere nivået av oksidativt stress i tarmstammeceller ved forskjellige behandlinger. Denne protokollen kan tilpasses for å teste påvirkningen av eksogene molekyler, for eksempel mikrobiota-avledet muramyl-dipeptid (MDP)10, på ROS-balansen, etter å ha stimulert organoider med de valgte forbindelsene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbeidet gir en trinnvis protokoll for å isolere murine jejunale krypter, dyrke dem i 3D-organoider og analysere ROS i organoider ved å kombinere en ROS-sensitiv fluorogen sonde med kvalitativ mikroskopiavbildning av hele organoider og kvantitativ ROS-måling ved hjelp av strømningscytometri på enkeltceller etter organoid dissosiasjon.
Det første kritiske trinnet i denne metoden er krypteruttrekkingsprosedyren. Faktisk er kvaliteten på krypterpreparat nøkkelen til vellykket organo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av French National Research Agency (ANR) grant 17-CE14-0022 (i-Stress).
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
