Murine Bağırsak Organoidlerinde Reaktif Oksijen Türlerine Duyarlı Florojenik Prob Kullanılarak Oksidatif Stresin Analizi
Summary
Mevcut protokol, nitel görüntüleme ve nicel sitometri tahlilleri kullanarak bağırsak murine organoidlerindeki reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu çalışma, seçilen bileşiklerin ROS üzerindeki etkisini test etmek için potansiyel olarak diğer floresan problara genişletilebilir.
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS) bağırsak homeostazında önemli roller oynar. ROS hücre metabolizmasının doğal yan ürünleridir. Antimikrobiyal yanıtlar ve yara iyileşmesinde rol aldıkları için mukozal düzeyde enfeksiyon veya yaralanmaya yanıt olarak üretilirler. Ayrıca, hücre büyümesi ve farklılaşma da dahil olmak üzere çeşitli yolları düzenleyen kritik ikincil habercilerdir. Öte yandan, aşırı ROS seviyeleri, hücreler için zararlı olabilen ve kronik iltihap veya kanser gibi bağırsak hastalıklarını destekleyen oksidatif strese yol açar. Bu çalışma, bağırsak murine organoidlerindeki ROS’yi canlı görüntüleme ve akış sitometrisi ile, piyasada bulunan florojenik bir prob kullanarak tespit etmek için basit bir yöntem sağlar. Burada protokol, bağırsak organoidlerindeki redoks dengesini modüle eden ve GFP ile genetik olarak etiketlenmiş bağırsak kök hücrelerinin analizi ile örneklenen belirli bağırsak hücre tiplerindeki ROS seviyelerini tespit eden bileşiklerin etkisini test etmeyi açıklamaktadır. Bu protokol diğer floresan problarla kullanılabilir.
Introduction
Reaktif oksijen türleri (ROS) hücresel metabolizmanın doğal yan ürünleridir. Ayrıca, süperoksit anion ve hidrojen peroksit1 üreten membran bağlı NADPH-Oxidases (NOX) ve Çift Oksidaz (DUOX) gibi özel enzimatik kompleksler tarafından da aktif olarak üretilebilirler. Antioksidan enzimleri ve ROS çöpçülerini ifade ederek, hücreler redoks dengelerini ince bir şekilde ayarlayabilir ve böylece doku homeostazını koruyabilir2. ROS hücreler için oldukça toksik olmasına ve DNA, protein ve lipitlere zarar verebilmesine rağmen, çok önemli sinyal molekülleridir2. Bağırsak epitelinde, kök ve progenitör hücre çoğalması için orta derecede ROS seviyeleri gereklidir3; yüksek ROS seviyeleri apoptozlarına yol açar4. Kronik oksidatif stres, enflamatuar bağırsak hastalıkları veya kanser gibi birçok gastrointestinal hastalıkla bağlantılıdır. Örnek olarak, Wnt güdümlü bağırsak kanserinin bir fare modelinde, NADPH-oksidazların aktivasyonu yoluyla yüksek ROS üretiminin kanser hücrelerinin hiperproliferasyon için gerekli olduğu bulunmuştur5,6. Bağırsak hücrelerinin, özellikle kök hücrelerin, kök hücrelerin oksidatif stresi nasıl yönettiğini ve hücresel ortamın bu kapasiteyi nasıl etkileyebileceğini tanımlamak, bu hastalığın etiyolojisini daha iyi anlamak için gereklidir7.
Bir dokuda, farklı hücre tipleri işlevlerine ve metabolizmalarına ve değişen oksidan ve antioksidan molekül seviyelerinin ifadelerine göre değişebilen bazal oksidatif bir durum sunar4,7. Ros in vivo’nun izlenmesi çok zor. Redoks durumlarına göre floresan yayan hücre geçirgen boyaları, canlı hücrelerde ve hayvanlarda hücresel ROS’yi görselleştirmek ve ölçmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, etkinliği canlı dokuların içindeki difüzyonlarına ve hızlı okumalarına bağlıdır, bu da onları hayvan modellerinde kullanımını zorlaştırır8.
Geçmişte, bileşiklerin ROS üretimi üzerindeki etkisinin incelenmesi hücre hatları kullanılarak yapılmıştır, ancak bu in vivo durumu yansıtmayabilir. Clevers9 grubu tarafından geliştirilen bağırsak organoid modeli, bağırsak birincil hücrelerinin eks vivo büyümesini sağlar. Matrislerdeki bağırsak mahzenleri kültürü, tanımlanmış büyüme faktörlerinin varlığında, kripto-villus organizasyonuni yeniden üreten organoidler (mini bağırsak) adı verilen üç boyutlu yapılara, iç lümeni kaplayan farklı epitel soyundan hücrelere ve küçük mahzen benzeri çıkıntılarda bulunan bağırsak kök hücrelerine yol açar.
Burada, bu modelden yararlanarak, organoid kültür ortamına ticari olarak mevcut bir ROS duyarlı boya ekleyerek birincil bağırsak hücrelerindeki oksidatif stresi tek hücreli çözünürlükte incelemek için basit bir yöntem tanımlanmıştır.
Plaka okuyucular genellikle toplam popülasyonda ROS üretimini tespit etmek için kullanılır. Bu protokol, genetiği değiştirilmiş hücreler veya spesifik antikor lekeleme ile belirli bir hücre tipinde ROS’yi tespit etmek için akış sitometrisi veya görüntüleme testi kullanır. Bu çalışma fare bağırsak organoid kültürünü ve ros görselleştirmeyi konfokal görüntüleme ve akış sitometrisi ile nicelemesini içerir. Lgr5-GFP fare türevi küçük bağırsak organoidlerini kullanarak, farklı tedaviler üzerine bağırsak kök hücrelerindeki oksidatif stres seviyesini özellikle analiz etmek mümkündür. Bu protokol, seçilen bileşiklerle organoidleri uyarladıktan sonra mikrobiyota türevli muramil-dipeptid (MDP)10 gibi eksojen moleküllerin ROS dengesi üzerindeki etkisini test etmek için uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, murine jejunal mahzenleri izole etmek, 3D organoidler halinde kültürlemek ve ROS’a duyarlı florojenik bir probu tüm organoidlerin nitel mikroskopisi ve organoid ayrışmasını takiben tek hücrelerde akış sitometrisi kullanarak nicel ROS ölçümü ile birleştirerek organoidlerde ROS’u analiz etmek için adım adım bir protokol sağlar.
Bu yöntemin ilk kritik adımı, mahzen çıkarma prosedürüdür. Gerçekten de, mahzenlerin hazırlanmasının kalitesi başarılı o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) hibe 17-CE14-0022 (i-Stress) tarafından desteklendi.
Materials
| Mice | |||
| Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) | The Jackson Laboratory | ||
| Growth culture medium | |||
| Advanced DMEM F12 (DMEM/F12) | ThermoFisher | 12634010 | |
| B-27 Supplement, minus vitamin A | ThermoFisher | 12587010 | Stock Concentration: 50x |
| GlutaMAX (glutamine) | ThermoFisher | 35050038 | Stock Concentration: 100x |
| Hepes | ThermoFisher | 15630056 | Stock Concentration: 1 M |
| Murine EGF | R&D | 2028-EG-200 | Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS |
| murine Noggin | R&D | 1967-NG/CF | Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS |
| Murine R-spondin1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | Stock Concentration: 100x |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | ThermoFisher | 15140122 | Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin) |
| Material | |||
| 70 µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96-well round bottom | Corning | 3799 | |
| ball tip scissor | Fine Science Tools GMBH | 14086-09 | |
| CellROX® Deep Red Reagent | ThermoFisher | C10422 | |
| DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe) | ThermoFisher | D1306 | stock at 10 mg/mL |
| DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS) | ThermoFisher | 14190144 | |
| FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red) | ThermoFisher | A1896701 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | H3570 | stock at 10 mg/mL |
| Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix) | Corning | 356231 | once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C |
| µ-Slide 8 Well chambers | Ibidi | 80826 | |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma | A9165 | |
| tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2) | Sigma | 458139 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin) | ThermoFisher | 12604013 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation |
| Programs and Equipment | |||
| Attune NxT (Flow Cytometer) | ThermoFischer | Flow cytometer analyzer | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | images generation | |
| FlowJo | BD Bioscience | FACS analysis | |
| Observer.Z1 | Zeiss | confocal system | |
| Opterra (swept-field confocal) | Bruker | confocal system | |
| high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512 | Photometrics | confocal system | |
| Prism | GraphPad Software | statistical analysis |
References
- Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
- Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
- vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949 (2021).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
- Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
- Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
- Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
- Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
- Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
- Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
- Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
- Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316 (2010).
- Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
