Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Bestemmelse av mitokondrie respirasjon og glykolyse i Ex Vivo retinal vevsprøver

Published: August 4, 2021 doi: 10.3791/62914
Automatic Translation
1, 1, 1
1Neurobiology, Neurodegeneration & Repair Laboratory, National Eye Institute, National Institutes of Health

Summary

Beskrevet her er en detaljert protokoll for å utføre mitokondrie stressanalyse og glykolytisk hastighetsanalyse i ex vivo retinal vevsprøver ved hjelp av en kommersiell bioanalyse.

Abstract

Mitokondrie respirasjon er en kritisk energigenererende vei i alle celler, spesielt retinal fotoreseptorer som har en svært aktiv metabolisme. I tillegg viser fotoreseptorer også høy aerob glykolyse som kreftceller. Presise målinger av disse metabolske aktivitetene kan gi verdifull innsikt i cellulær homeostase under fysiologiske tilstander og i sykdomstilstander. Mikroplatebaserte analyser med høy gjennomstrømning er utviklet for å måle mitokondrie-respirasjon og ulike metabolske aktiviteter i levende celler. Imidlertid er et stort flertall av disse utviklet for dyrkede celler og har ikke blitt optimalisert for intakte vevsprøver og for anvendelse ex vivo. Beskrevet her er en detaljert trinnvis protokoll, ved hjelp av mikroplatebasert fluorescensteknologi, for å måle oksygenforbrukshastigheten (OCR) direkte som en indikator på mitokondrie respirasjon, samt ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) som en indikator på glykolyse, i intakt eks vivo retinal vev. Denne metoden har blitt brukt til å vurdere metabolske aktiviteter i voksen mus netthinne og demonstrere sin anvendelse i å undersøke cellulære mekanismer for aldring og sykdom.

Introduction

Mitokondrier er essensielle organeller som regulerer cellulær metabolisme, signalering, homeostase og apoptose ved å koordinere flere viktige fysiologiske prosesser1. Mitokondrier fungerer som kraftstasjonen i cellen for å generere adenosintrifosfat (ATP) gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS) og gi energi som støtter nesten alle cellulære hendelser. Mesteparten av cellulær oksygen metaboliseres i mitokondrier, hvor det fungerer som den endelige elektron akseptoren i elektrontransportkjeden (ETC) under aerob åndedrett. Lave mengder ATP kan også produseres fra glykolyse i cytosolen, hvor glukose omdannes til pyruvat, som kan omdannes ytterligere til laktat eller transporteres til mitokondrier og oksideres til acetyl-CoA, et substrat i trikarboksylsyresyklusen (TCA-syklus).

Netthinnen er et av de mest metabolsk aktive vevene hos pattedyr2, og viser høye nivåer av mitokondrie respirasjon og ekstremt høyt oksygenforbruk3. Stangen og kjeglefotoreseptorene inneholder en høy tetthet av mitokondrier4, og OXPHOS genererer de fleste ATP i netthinnen5. I tillegg er netthinnen også avhengig av aerob glykolyse6,7 ved å konvertere glukose til laktat5. Mitokondriefeil er forbundet med ulike nevrodegenerative sykdommer8,9; og med sine unike høye energibehov er netthinnen spesielt sårbar for metabolske defekter, inkludert de som påvirker mitokondrie OXPHOS4 og glykolyse10. Mitokondrie dysfunksjon og defekter i glykolyse er involvert i retinal11,12 og macular13 degenerative sykdommer, aldersrelatert makuladegenerasjon10,14,15,16, og diabetisk retinopati17,18. Derfor kan nøyaktige målinger av mitokondrie respirasjon og glykolyse gi viktige parametere for å vurdere integriteten og helsen til netthinnen.

Mitokondrie respirasjon kan måles gjennom bestemmelse av oksygenforbruk (OCR). Gitt at konvertering av glukose til pyruvat og deretter å laktere resulterer i ekstrudering av protoner til og forsuring av det ekstracellulære miljøet, gir målinger av den ekstracellulære forsuringsraten (ECAR) en indikasjon på glykolysefluks. Siden netthinnen består av flere celletyper med intime relasjoner og aktiv synergi, inkludert utveksling av substrater6, er det viktig å analysere mitokondriefunksjon og metabolisme i sammenheng med hele netthinnevev med intakt laminering og kretser. De siste tiårene har Clark type O2-elektroder og andre oksygenmikroelektroder blitt brukt til å måle oksygenforbruket i netthinnen19,20,21. Disse oksygenelektrodene har store begrensninger i følsomhet, krav til et stort prøvevolum og behovet for kontinuerlig omrøring av suspendert prøve, noe som vanligvis fører til forstyrrelse av cellulær og vevskontekst. Protokollen beskrevet her ble utviklet ved hjelp av en mikroplatebasert fluorescensteknikk for å måle mitokondrieenergimetabolisme i ny dissekert ex vivo mus netthinnevev. Det tillater mid-throughput sanntidsmålinger av både OCR og ECAR samtidig ved hjelp av en liten prøve (1 mm punch) av ex vivo retinal vev samtidig unngå behovet for suspensjon og kontinuerlig omrøring.

Demonstrert her er den eksperimentelle prosedyren for mitokondrie stressanalyse og glykolytisk hastighetsanalyse på ny dissekerte retinal punch disker. Denne protokollen tillater måling av mitokondrier-relaterte metabolske aktiviteter i en ex vivo vev kontekst. Forskjellig fra analysene som utføres ved hjelp av dyrkede celler, gjenspeiler målingene som er oppnådd her kombinert energimetabolisme på vevsnivå og påvirkes av interaksjoner mellom de forskjellige celletypene i vevet. Protokollen er modifisert fra en tidligere publisert versjon22,23 for å tilpasse seg den nye generasjonen av Agilent Seahorse ekstracellulær flux 24-brønner (XFe24) analysator med Islet Capture plate. Analysemediet, konsentrasjonene av injeksjonsforbindelser og antall/varighet av analysesykluser er også optimalisert for netthinnevev. En detaljert trinnvis protokoll er gitt for fremstilling av retinal punch-disker. Mer informasjon om programoppsett og dataanalyse kan fås fra produsentens brukerhåndbok24,25,26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle museprotokoller ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen ved National Eye Institute (NEI ASP# 650). Mus ble plassert i 12 timer lyse mørke forhold og brydde seg om ved å følge anbefalingene fra Guide for care and use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources og Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals.

1. Fuktighetsgivende sensorpatron og tilberedning av analysemediet

  1. Dagen før eksperimentet legger du til 1 ml av kalibreringsmediet til hver brønn på verktøyplaten. Plasser Hydro-Booster-dekselet på toppen og senk sensorpatronen gjennom åpningen på dekselet. Kontroller at sensoren er nedsenket i kalibreringsmediet. Inkuber sensorpatronen over natten i en CO2-fri inkubator ved 37 °C for å aktivere fluoroforene.
    MERK: For å unngå fordampning fuktes inkubatoren ved å holde et brett med vann inni, og sensorkassetten er pakket inn med klar plastfolie.
  2. Forbered analysemediet ved å rekonstituere Seahorse DMEM-mediet med tilsetning av glukose, pyruvat og glutamin til de ønskede konsentrasjonene. I analysene som er rapportert i denne artikkelen, er den endelige konsentrasjonen av substrater i analysemediet: 6 mM glukose, 0,12 mM pyruvat og 0,5 mM glutamin. For hver analyseplate fremstilles 40 ml av analysemediet friskt på eksperimentets dag.
  3. Sett opp analyseprogrammet i analysatoren i henhold til produsentens instruksjon26. I analysen som er demonstrert her, er protokollen satt som følger: 5 sykluser med målinger for baseline, deretter injisere port A, etterfulgt av 4 sykluser med målinger, deretter injisere port B og etterfulgt av 4 sykluser med målinger. Hver syklus består av blanding (3 min), vent (2 min) og mål (3 min).

2. Belegg mesh innsatser av holme fange mikroplate

  1. Forbered beleggblandingen ved å kombinere 20 μL av celletilbehørsmediet (f.eks. cell-tak) med 171 μL 0,1 M natriumbikarbonat og 9 μL 1 M NaOH.
  2. Åpne lokket på kassetten som inneholder nettinginnlegg. Pipette 8 μL av beleggblandingen til hver maskeinnsats. Bruk en pipettespiss til forsiktig å smøre/spre dråpen rundt for å fordele beleggblandingen likt gjennom nettinginnsatsen.
  3. Lukk kassetten og la maskeinnleggene inkubere ved romtemperatur i minst 25 minutter for adsorpsjon.
  4. Vask nettinginnsatsen ved å pipettere 4 ml av analysemediet direkte på nettinginnleggene. Rist kassetten forsiktig for å sikre at alle nettinginnlegg vaskes med analysemediet.
  5. Hold maskeinnsatsen til side. Den er klar til bruk.

3. Klargjøring av injeksjonsforbindelser

  1. Ta ut lager aliquots av Bam15 (10 mM), Rotenone (10 mM), Antimycin A (10 mM) og 2-DG (500 mM) fra -80 °C fryser og tine ved romtemperatur.
    MERK: 2-DG-aksjen er klar til bruk. De andre stoffene må fortynnes til arbeidsbestanden.
  2. Varm opp 10 ml av analysemediet i et vannbad på 37 °C.
  3. Fortynn 10 mM Bam15 lager til 50 μM arbeidslager ved hjelp av en to-trinns fortynningsprosedyre: bland 20 μL 10 mM lager med 20 μL DMSO for å få 5 mM mellomlager. Bland deretter 10 μL av det ovennevnte 5 mM mellomlageret med 990 μL forvarmet analysemedium for å få det endelige 50 μM arbeidslageret.
  4. Fortynn og kombiner 10 mM rotenon og 10 mM Antimycin A-lager til 10 μM Rotenone/Antimycin A (Rot/AA) arbeidslager med to trinn for fortynning: bland 10 μL hver av 10 mM Rotenone og 10 mM Antimycin A-lager med 80 μL DMSO for å få 1 mM Rot/AA mellomlagre. Bland deretter 10 μL av det ovennevnte 1 mM mellomlageret med 990 μL forvarmet analysemedium for å få det endelige 10 μM Rot / AA arbeidslageret.
  5. Forbered de ovennevnte arbeidsmassene av injeksjonsforbindelser på eksperimentets dag og sett dem til side ved romtemperatur til de lastes inn i injeksjonsportene til sensorpatronen.

4. Retinal disseksjon og retinal punch forberedelse

  1. Euthanize en mus ved CO2-kvelning etter AVMA Retningslinjer for Eutanasi27.
    MERK: Ikke la dyret ligge i et CO2-kammer lenger enn tiden det tar for eutanasi.
  2. Enucleate øyne og plassere i is-gamle 1x PBS buffer i en Petri-tallerken og deretter plassere den under en disseksjon mikroskop.
  3. Fjern forsiktig, ved å kutte med mikroscissorer, de ekstra rektusmusklene festet utenfor øyebollet og kutt av synsnerven.
  4. Bruk en 30 G nål for å slå et hull på kanten av hornhinnen (limbus); Dette fungerer som innsettingssted for mikroscissorene. Bruk deretter en fin disseksjonsmikroscissorer for å lage et sirkulært kutt langs kanten av hornhinnen, skille den fra den bakre øyekoppen.
  5. Bruk skarpe disseksjons tang for å fjerne hornhinnen, linsen og glasslegemet humor bort fra øyekoppen.
  6. Bruk fine disseksjonsmikroscissorer for å lage flere små kutt på sclerallaget ved kanten av øyekoppen. Unngå å kutte netthinnelaget. Bruk to skarpe disseksjons tang for å holde fast i skleralvevet på hver side av kuttet og trekk forsiktig på sclerallaget for å fjerne det fra nevral netthinnen. Gjenta dette rundt øyekoppen til alle sclera er fjernet og en intakt netthinnekopp er oppnådd.
  7. Bruk disseksjonsmikroscissorer og lag radiale kutt på netthinnekoppen for å flate den ut og generere flere forskjellige seksjoner.
    MERK: Avhengig av personens disseksjonsevner og erfaring med håndtering av ferskt netthinnevev, kan netthinnekoppen kuttes for å generere 3 til 5 forskjellige seksjoner.
  8. Bruk biopsistanser med 1 mm diameter til å kutte en netthinneskive fra hver del av den flate netthinnekoppen.
    MERK: Det må utvises forsiktighet for å få retinalskivene stanset i like avstand fra synsnerven.
  9. Bruk tang til å overføre de forhåndsbelagte nettinginnleggene til dissekering petri-parabolen. Ved hjelp av to superfine øyenvippebørster plasserer du retinal punch-disken på maskeinnsatsen. Den retinal punch disk er plassert i midten av mesh innsats med ganglion celle lag side ned berøre mesh og photoreceptor laget vendt opp.
    MERK: Ofte forblir noen RPE-celler festet til fotoreseptorene, og pigmenteringen av disse cellene kan brukes som en indikator på retinal punch disk orientering.

5. Lasting av sensorpatroninnsprøytingsporter og kalibrering

  1. Ta kassetten med den hydrerte sensorkassetten ut av inkubatoren på 37 °C. Fjern Hydro-Booster-dekselet og sett sensorkassetten tilbake på strømplaten.
  2. Last inn ønsket volum av injeksjonssammensetningens arbeidslagerløsninger i passende porter. Hold pipettespissen i 45 ° vinkel. Sett pipettespissen halvveis inn i en injeksjonsport med spissens skråkant mot motsatt vegg av injeksjonsporten og last forsiktig forbindelsen inn i hver port. Unngå å introdusere luftbobler.
  3. Se instrumentets brukerhåndbok for volumet av forbindelsen som er lastet inn i hver injeksjonsport for en bestemt analyse. I forsøkene som presenteres i dette dokumentet, blir 68 μL av 50 μM Bam15 arbeidslager (for mitokondriestressanalyse) eller 68 μL 10 μM Rot / AA arbeidslager (for glykolytisk hastighetsanalyse) lastet inn i port A; 75 μL 10 μM rot/AA arbeidslager (for mitokondriespenningsanalyse) eller 75 μL 500 mM 2-DG arbeidslager (for glykolytisk hastighetsanalyse) lastes inn i port B.
  4. Lastinnsprøytingsporter i alle brønner på platen, inkludert bakgrunnskorreksjonsbrønner og tomme brønner for å sikre riktig injeksjon. Last den respektive sammensatte løsningen i hver port for bakgrunnskorrigeringsbrønnene. Analysemedium kan erstattes, i stedet for den sammensatte løsningen, i hver av havnene i bankbrønnene.
  5. Plasser den ladde sensorkassettplaten, med lokket av, i analysatormaskinen for å starte kalibreringen før analysen går. Etter at kalibreringen er over, vil programmet automatisk pause og vente på utskifting av strømplaten med holmen som inneholder netthinneslag.

6. Lasting av holmens opptaksplate og start analysekjøring

  1. Tilsett 607 μL av analysemediet til hver brønn på holmens opptaksplate
  2. Bruk tang til å gripe kanten av nettinginnsatsen som inneholder retinal punch disker på toppen og ta den ut fra Petri-parabolen. Trykk lett på bunnen av nettinginnsatsen på et absorberende tørkevev for å fjerne ekstra væske og sette den inn i brønnen på holmefangstplaten. Gjenta dette trinnet til alle nettinginnlegg med nettingstanser er plassert i holmens opptaksplate. Fyll bakgrunnskorrigeringsbrønner og tomme brønner med tomme nettinginnlegg.
  3. Bruk to Graefe tang for å forsiktig og forsiktig trykke på kanten av hver maskeinnsats og sørg for at disse er sikkert satt inn på bunnen av holmen opptaksplaten.
  4. Plasser den lastede holmens opptaksplate i en 37 °C inkubator i 5 minutter for å varme opp.
  5. Løs ut verktøyplaten etter at kalibreringen er fullført, og bytt den ut med en og erstatt den med holmens opptaksplate, med lokket av, som inneholder netthinneslag.
  6. Fortsett analysen.

7. Kjør avslutning og datalagring

  1. Når kjøringen er fullført, løser du ut sensorpatronen og holmen som inneholder netthinnestanser. Dataene lagres automatisk som ASYR-fil.
  2. Bruk den tilknyttede dataanalyseprogramvaren til å vise og analysere dataene i henhold til produsentens brukerhåndbok26.
  3. Bruk Eksport-funksjonen til å eksportere XSLX-filen av dataene, som kan vises og analyseres ved hjelp av regnearkprogramvare.

8. Lagre retinal punch prøven

  1. Etter analysen, ta ut platen fra maskinen, fjern sensorpatronen og fjern analysemediet forsiktig fra hver brønn ved hjelp av en pipette.
  2. Påfør dekselet tilbake på og forsegle sidene av platen med parafilmstripen.
  3. Oppbevars ved -80 °C.
  4. For normalisering kvantifiserer du det totale DNA- eller proteininnholdet i slaget i hver brønn.

9. Dataanalyse

  1. Mitokondrie stress analyse
    MERK: Den målte OCR-verdien (totalOCR) representerer totalt oksygenforbruk av vevet. Etter Bam15 -injeksjon (uncoupler) øker OCR fra basalnivået (totalOCRbasal) til maksimumsnivået (totalOCRmax) og går ned etter Rot/AA-injeksjonen. Den gjenværende OCR-verdien etter Rot/AA-injeksjon (totalOCRRot/AA) representerer ikke-mitokondrie oksygenforbruk.
    1. Beregn mitokondrierrelatert oksygenforbruk som:
      Equation 1 (Eq. 1) 28
    2. Beregn mitokondriereservekapasiteten (MRC) som:
      Equation 2 (Eq. 2) 29
      MERK: Den siste avlesningen blant de 5 målingene før Bam15-injeksjonen tas som "basal" -verdien (for totalOCRbasal og mitoOCRbasal). Den høyeste avlesningen blant de 4 målingene etter Bam15-injeksjonen brukes som "maks" verdi (for totalOCRmax og mitoOCRmax). Den laveste avlesningen blant de 4 målingene etter Rot/AA-injeksjonen brukes som totalOCRRot/AA.
  2. Glykolytisk hastighetsanalyse
    MERK: Den målte ECAR-verdien (totalECAR) representerer den totale forsuringen av mediet ved vevets metabolske aktivitet. Generelt resulterer forsuring av det ekstracellulære mikromiljøet hovedsakelig ved ekstrudering av glykolytisk produkt, laktat. Katabolisme av substrater i mitokondrie TCA syklus resulterer i produksjon av CO2, som også syrer det ekstracellulære mediet gjennom hydrering til bikarbonat.
    1. Substract mitokondrie bidro med middels forsuring (mititoECAR) fra totalECAR for å oppnå glycoECAR.
      Equation 3 (Eq. 3) 28
      MERK: Mitokondrie-åndedrett og TCA-syklus er sterkt koblede prosesser. Produksjon av CO2 fra mitokondrier er en funksjon av oksofosforhastigheten, som er målbar av mitoOCR.
    2. Beregn mitoECAR som:
      Equation 4 (Eq. 4) 28
      der CCF (CO2 Contribution Factor) er en empirisk beregnet forholdsverdi, som representerer mengden H + bidrag fra CO2-mediert forsuring vs hvert O2-forbruk fra OXPHOS. CCF for dette systemet er forhåndsbestemt til å være 0,6028. Nøyaktig måling av middels forsuring bestemmes av mediets bufferkapasitet, følsomheten til instrumentets pH-sensor og den effektive målekammerkapasiteten. Her er BF (Buffer Factor) en parameter for in situ eksperimentell bufferkapasitet, som representerer mengden H + eller OH - lagt til det effektive målekammeret for å endre pH-nivået med 1 enhet. Når tilpasset analysemedium brukes, kan BF bestemmes ved å titrere kjente mengder syre inn i analysemediet etter Buffer Factor-protokollen30. Seahorse DMEM medium pH 7.4 som brukes i denne protokollen har en forhåndsbestemt BF på 2,60 mmol H+/L/pH. Holmens opptaksplate som brukes i denne protokollen har en Volmicrochamber = 16,6 μL31. Volumskaleringsfaktoren Kvol er en empirisk bestemt konstant. Kvol-verdien er ikke tilgjengelig for holmefangstplaten, men kan beregnes ut fra verdien av mikroplaten28, som står for volumforskjellen i mikrokamberne, til 0,41.
      MERK: Injeksjon av Rot/AA slår av mitokondrie-respirasjon og tvinger vevet til å bytte til glykolyse for ATP-produksjon, noe som fører til høyere laktatekstrudering og en økning i ECAR-måling. Glykolyse opphøres med 2-DG injeksjon, og resterende ECAR måling avslører ikke-glykolytisk og ikke-mitokondrie forsuring av medium.
    3. Beregn glykolytisk reservekapasitet (GRC) som:
      Equation 5 (Eq. 5) 32
      hvor den siste avlesningen blant de 5 målingene før Rot/AA-injeksjonen tas som "basal" -verdien (glycoECARbasal). Den høyeste avlesningen blant de 4 målingene etter Rot/AA-injeksjonen brukes som "maks"-verdi (glycoECARmax). Den laveste avlesningen blant de 4 målingene etter 2-DG injeksjon brukes som glycoECAR2-DG.
  3. Normalisering
    MERK: Normalisering er viktig når man sammenligner avlesningene fra netthinnevev i ulike aldersgrupper eller mellom ville og patologiske/degenerative prøver, som kan variere i celletall.
    1. Bruk kommerisk tilgjengelige sett for å vurdere DNA-innholdet i hver retinal punch disk33,34.
    2. Alternativt kan du bruke radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer) for å trekke ut totalt protein fra retinal punch og bruke proteininnholdet til normalisering.
      MERK: Overflatearealet til en voksen mus netthinne har tidligere blitt fastslått å være rundt 20 mm2, og hver netthinne inneholder ~ 6,5 millioner celler35. Derfor er hver 1 mm diameter retinal punch ~ 1/25 av en enkelt netthinne og inneholder ~ 260K celler. Man kan referere til disse tallene når man sammenligner dataene fra en netthinnestans med de fra andre vevsprøver eller dyrkede celler,

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dataene som rapporteres her er representativ mitokondriestressanalyse som viser OCR-spor (figur 1) og glykolytisk hastighetsanalyse som viser OCR-spor og ECAR-spor (figur 2), som ble utført ved hjelp av ny dissekerte 1 mm retinal punch disker fra 4 måneder gamle transgene Nrl-L-EGFP mus36 (C57B / L6 bakgrunn). Disse musene uttrykker GFP spesielt i stang fotoreseptorer uten å endre normal retinal utvikling, histologi og fysiologi og har blitt mye brukt som villtypekontroller i retinal forskning. To Nrl-L-GFP kullmatmus ble brukt i analysene som ble presentert her. GFP uttrykt i Nrl-L-GFP-musene forstyrrer ikke målingene av OCR og ECAR i denne protokollen. Fem retinal slag ble tatt fra hver netthinne. Ti av retinal slag ble brukt til mitokondrie stress analyse og de andre 10 ble brukt til glykolytisk rate analyse. Seahorse XF DMEM medium, pH 7,4 (utgjorde med 6 mM glukose, 0,12 mM pyruvat og 0,5 mM glutamin) og Seahorse XFe24 Islet Capture-plater ble brukt i forsøkene. De representative dataene som presenteres her ble innhentet ved hjelp av samme 1 mm diameter puncher, men ble ikke normalisert med hensyn til DNA / proteininnholdet.

I mitokondriestressanalyse ble uncoupler Bam1537 injisert etter å ha etablert OCR-grunnlinjen, noe som førte til forbedret OCR til maksimalt nivå. Rotenon og Antimycin A ble injisert for å hemme mitokondrierespirasjon ved henholdsvis kompleks I og kompleks III, noe som resulterte i at OCR falt til det minimale nivået (figur 1). Forskjellen mellom det maksimale nivået av OCR og den siste målingen av basal OCR-nivået gjenspeiler mitokondrie reservekapasitet (MRC). MRC er beregnet til å være 19,2% ±3,4% ved hjelp av Eq. 2, i samsvar med tidligere målte MRC-verdier i netthinner på ~ 3 måneder gamle Nrl-L-EGFP-mus ved hjelp av forrige generasjon Seahorse XF24 analysator22,38.

I glykolytisk hastighetsanalyse ble Rotenone og Antimycin A injisert etter å ha etablert baseline for den totale ECAR. Med produksjonen av ATP fra OXPHOS stoppet, blir vevet tvunget til å stole på glykolyse for energi, og en økning i den ekstracellulære frigjøringen av laktat driver ECAR til maksimalt nivå. Glykolyse opphøres ved injeksjon av 2-DG, som konkurrerer med glukose for hexokinasebinding, noe som får ECAR til å falle til det minimale nivået (figur 2). Mitokondrier bidratt ECAR (mititoECAR) kan beregnes ut fra mitokoNDR-verdien (Eq. 4). Glykolyse bidratt ECAR glycoECAR beregnes og plottes ved å trekke mitoECAR fra totalECAR. Forskjellen mellom maksimalt nivå av glycoECAR og den siste målingen av glycoECAR basal nivå gjenspeiler glykolyse reserve kapasitet (GRC). Her er GRC beregnet til å være 35,7% ± 3,4% ved hjelp av Eq. 5.

Som et svært glykolytisk vev står laktatproduksjon fra netthinnen for en stor kilde til ekstracellulær forsuring, som avslørt av den lille forskjellen på glycoECAR fra totalECAR. Interessant nok, ECAR måling ikke platå umiddelbart etter Rot / AA injeksjon, men faller etter den andre målingen. Retinal punch disk er et intakt ex vivo-system som består av forskjellige celletyper, inkludert Müller glia-cellene, som er kjent for å motta laktat (glykolyse sluttprodukt) utgitt fra fotoreseptorene6. Derfor forklares en nedgang i ECAR-måling etter Rot / AA-injeksjonen sannsynligvis ved økt fjerning av laktat fra det intercellulære rommet, noe som bremser ned / forhindrer frigjøring i mediet.

Figure 1
Figur 1: Mitokondrie stressanalyse. Den plottede grafen viser OCR-spor fra 1 mm retinal punch disker i Seahorse XF DMEM buffer, supplert med 6 mM glukose, 0,12 mM pyruvat og 0,5 mM glutamin. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av målinger fra 10 brønner. Feilfelt = standardfeil. MRC er beregnet til 19,2 % ±3,4 %. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Glykolytisk hastighetsanalyse. Den plottede grafen viser det målte OCR-sporet, ECAR-sporet (totalECAR), og den beregnede glykolysen bidro med ECAR (glycoECAR) fra 1 mm retinal punch disker i Seahorse XF DMEM buffer supplert med 6 mM glukose, 0,12 mM pyruvat og 0,5 mM glutamin. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av målinger fra 10 brønner. Feilfelt = standardfeil. GRC er beregnet til 35.7%±3.4% Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her er detaljerte instruksjoner for å utføre mikroplatebaserte analyser av mitokondrie-respirasjon og glykolyseaktivitet ved hjelp av ex vivo, ny dissekerte retinal punch disker. Protokollen er optimalisert for å: 1) sikre bruk av et egnet analysemedium for ex vivo retinal vev; 2) bruke riktig størrelse på retinal punch disker for å oppnå OCR og ECAR avlesninger som faller innenfor maskinens optimale detekteringsområde; 3) belegg mesh innsatser for å forbedre klebeevnen av retinal punch for stabil lesing under målesyklusen; 4) bruk av optimal konsentrasjon av hver injisert narkotika forbindelser; og 5) sikre endret sykluslengde for å nå et platå av mitokondrietilstander ved hvert trinn. Reagensene og protokollen er endret fra en tidligere publisert versjon23 for å tilpasse seg den nye generasjonen Seahorse XFe24-maskin. I stedet for Ames' buffer som ble brukt i den forrige protokollen23, brukes et grunnleggende Seahorse DMEM-medium her for å tillate den tilpassede konstitusjonen av drivstoffkilde ved å legge til glukose, glutamin og pyruvat separat. Dette gjør det også mulig å utføre ulike analyser der et spesifikt drivstoffsubstrat leveres eller fratas fra mediet. I analysene som presenteres her, ble mediet utgjort til samme konsentrasjon av glukose (6 mM), glutamin (0,5 mM) og pyruvat (0,12 mM) som i Ames buffer, som er bevist egnet for netthinnevev. En annen fordel med dette mediet (med 5 mM HEPES) over Ames' buffer (med 22,6 mM NaHCO3) er den lave bufferkapasiteten, noe som sikrer sensitiv og nøyaktig måling av ECAR28.

Både mitokondriestress og glykolytiske hastighetsanalyser kan utføres etter protokollen beskrevet her med høy presisjon, noe som fremgår av de stramme standardfeilverdiene mellom replikering av brønner. Det er imidlertid verdt å merke seg faktorene som kan bidra til datavariabilitet. Unngå celledød i netthinnevev. Hele avhandlingsprosessen skal utføres i iskald 1x PBS, og prosessen fra enucleation av øyne til å sette holmefangstplate som inneholder netthinnestansen inn i maskinen, bør ikke overstige 2 timer. Forsiktighet bør utvises under disseksjonen av netthinnekoppen for å unngå skade på netthinnen vev, og slag bør ikke tas fra områder som er skadet av disseksjon. Ny, skarp biopsi puncher bør brukes i hvert eksperiment, og endre puncher når kanten er kjedelig eller bøyd for å sikre konsistens og nøyaktighet i kutte retinal slag med 1 mm diameter. Prøv å få retinal disker stanset på equidistant fra synsnerven hodet for å unngå regionale variasjoner (senter versus perifer). Etter analysen, sjekk hver brønn for tegn på at netthinnestansen løsnes fra maskeinnsatsen. Når en retinal punch har dårlig vedheft på maskeinnsats eller løsner under måling, vil avstanden fra sensorsonden til vevet endres, noe som påvirker målingene. Utelat dataene fra slike brønner med løsrevet retinal punch.

Måling av sanntids mitokondriemetabolismen i intakt netthinnevev har brede anvendelser og kan gi nyttig informasjon for ulike studier. Disse analysene har blitt brukt til å måle mitokondrie respirasjon i retinal vev fra mus med forskjellig genetisk bakgrunn for å avsløre deres iboende forskjell i mitokondrieaktivitet39,40. Det ble også brukt til å studere endringer i mitokondrie energi metabolisme under aldring av netthinnen38. Ved å tilby forskjellige drivstoffsubstrater og bruke ulike inhibitorer rettet mot forskjellige metabolske veier, gir det innsikt i preferansen til cellen / vevet på visse drivstoffkilder22,38. Videre kan sammenligning på OCR og MRC mellom wild-type mus- og musemodeller av arvelig retinal degenerasjon gi bevis på mitokondriefeil ved degenerering av netthinne22.

Det er begrensninger i denne teknikken. Isletfangstplaten som brukes i disse analysene inneholder bare 24 brønner; Derfor er det bare i stand til å gi mid-throughput analyse. Datakvaliteten fra denne metoden er avhengig av kvaliteten på retinal punch disker og levedyktighet av celler. Også retinal disseksjon og retinal punch disker forberedelse er en tidkrevende prosess, noe som gjør det mindre mulig å høy-gjennomstrømning analyse på levende ex vivo retinal vev selv når 96-brønn plater er tilgjengelige. Sammenlignet med en monolayer av dyrkede celler, påvirker penetrasjon av legemiddelforbindelse i netthinnevevet også dataavlesning. I tillegg representerer de målte OCR- og ECAR-verdiene den totale ytelsen til hele vevet, som består av mange forskjellige celletyper; Derfor må man vurdere forholdet og interaksjonene mellom forskjellige nevronale og glialceller i netthinnen mens man tolker dataene. Spesifikke eksperimentelle design bør implementeres ved å skreddersy til hvert prosjekt. Det anbefales at man inkluderer 3 til 5 retinal slag (fra samme øye eller samme mus) som teknisk replikerer og bruker prøver fra 3 eller flere mus som biologiske replikerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av Intramural Research Program ved National Eye Institute (ZIAEY000450 og ZIAEY000546).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X PBS Thermo Fisher 14190-144
2-Deoxy glucose (2-DG), 500 mM stock solution Sigma D6134 Dissolve in Seahorse XF DMEM medium, prepare ahead of time
30-gauge needle BD Precision Glide 305106
Antimycin A, 10 mM stock solution Sigma A8674 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Bam15, 10 mM stock solution TimTec ST056388 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Biopsy puncher, 1 mm Integra Miltex 33-31AA
Cell-Tak Corning Life Sciences CB40240
CO2 asphyxiation chamber
Dissection forceps-Dumont #5 Fine Science Tools 11251-10 Stright tip
Dissection forceps-Dumont #7 Fine Science Tools 11274-20 Curved tip
Dissection microscope
DMSO Sigma D2438
Graefe forceps Fine Science Tools 11051-10 Curved, Serrated tip
Microscissors Fine Science Tools 15004-08 Curved tip
NaOH solution, 1 M Sigma-Aldrich S8263 Aqueous solution, prepare ahead of time
Rotenone, 10 mM stock solution Sigma R8875 Dissolve in DMSO, prepare ahead of time
Seahorse calibration medium Agilent 100840-000
Seahorse XF 1.0 M glucose Agilent 103577-100
Seahorse XF 100 mM pyruvate Agilent 103578-100
Seahorse XF 200 mM glutamine Agilent 103579-100
Seahorse XF DMEM medium Agilent 103575-100 pH 7.4, with 5 mM HEPES
Seahorse XFe24 Islet Capture FluxPak Agilent 103518-100 Containing Sensor Cartridge and Islet Capture microplate
Seahorse XFe24, Extra Cellular Flux Analyzer Agilent
Sodium bicarbonate solution, 0.1 M Sigma-Aldrich S5761 Aqueous solution, prepare ahead of time
Superfine eyelash brush Ted Pella 113

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  2. Wong-Riley, M. T. Energy metabolism of the visual system. Eye Brain. 2, 99-116 (2010).
  3. Yu, D. Y., Cringle, S. J. Oxygen distribution and consumption within the retina in vascularised and avascular retinas and in animal models of retinal disease. Progress in Retina and Eye Research. 20, 175-208 (2001).
  4. Barot, M., Gokulgandhi, M. R., Mitra, A. K. Mitochondrial dysfunction in retinal diseases. Current Eye Research. 36 (12), 1069-1077 (2011).
  5. Joyal, J. S., Gantner, M. L., Smith, L. E. H. Retinal energy demands control vascular supply of the retina in development and disease: The role of neuronal lipid and glucose metabolism. Progress in Retina and Eye Research. 64, 131-156 (2018).
  6. Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas. Journal of Neuroscience Research. 93 (7), 1079-1092 (2015).
  7. Haydinger, C. D., Kittipassorn, T., Peet, D. J. Power to see-Drivers of aerobic glycolysis in the mammalian retina: A review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 48 (8), 1057-1071 (2020).
  8. Wright, A. F., et al. Lifespan and mitochondrial control of neurodegeneration. Nature Genetics. 36, 1153-1158 (2004).
  9. Bossy-Wetzel, E., Schwarzenbacher, R., Lipton, S. A. Molecular pathways to neurodegeneration. Nature Medicine. 10, Suppl 2-9 (2004).
  10. Leveillard, T., Philp, N. J., Sennlaub, F. Is retinal metabolic dysfunction at the center of the pathogenesis of age-related macular degeneration. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), (2019).
  11. Vlachantoni, D., et al. Evidence of severe mitochondrial oxidative stress and a protective effect of low oxygen in mouse models of inherited photoreceptor degeneration. Human Molecular Genetics. 20 (2), 322-335 (2011).
  12. Grenell, A., et al. Loss of MPC1 reprograms retinal metabolism to impair visual function. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (9), 3530-3535 (2019).
  13. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews in Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).
  14. Jarrett, S. G., Boulton, M. E. Consequences of oxidative stress in age-related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 399-417 (2012).
  15. Rozing, M., et al. Age-related macular degeneration: A two-level model hypothesis. Progress in Retina Eye Research. 76, 100825 (2020).
  16. Yokosako, K., et al. Glycolysis in patients with age-related macular degeneration. Open Ophthalmology Journal. 8, 39-47 (2014).
  17. Bek, T. Mitochondrial dysfunction and diabetic retinopathy. Mitochondrion. 36, 4-6 (2017).
  18. Yumnamcha, T., Guerra, M., Singh, L. P., Ibrahim, A. S. Metabolic dysregulation and neurovascular dysfunction in diabetic retinopathy. Antioxidants. 9 (12), Basel. (2020).
  19. Futterman, S., Kinoshita, J. H. Metabolism of the retina. I. Respiration of cattle retina. Journal of Biological Chemistry. 234 (4), 723-726 (1959).
  20. Linsenmeier, R. A. Effects of light and darkness on oxygen distribution and consumption in the cat retina. Journal of General Physiology. 88 (4), 521-542 (1986).
  21. Medrano, C. J., Fox, D. A. Oxygen consumption in the rat outer and inner retina: light- and pharmacologically-induced inhibition. Experiments in Eye Research. 61 (3), 273-284 (1995).
  22. Kooragayala, K. Quantification of oxygen consumption in retina ex vivo demonstrates limited reserve capacity of photoreceptor mitochondria. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).
  23. Adlakha, Y. K., Swaroop, A. Determination of mitochondrial oxygen consumption in the retina ex vivo: applications for retinal disease. Methods in Molecular Biology. 1753, 167-177 (2018).
  24. Agilent Mitocondrial stress test user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Cell_Mito_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021).
  25. Agilent Glycolytic rate assay user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/103344-400.pdf (2021).
  26. Agilent wave 2.6 user guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/S7894-10000_Rev_C_Wave_2_6_User_Guide.pdf (2021).
  27. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Available from: https://www.avma.org/sites/default/files/2020-01/2020-Euthanasia-Final-1-17-20.pdf (2021).
  28. Improving Quantification of Cellular Glycolytic Rate Using Agilent Seahorse XF Technology. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/whitepaper/public/whitepaper-improve-quantification-of-cellular-glycolytic-rate-cell-analysis-5991-7894en-agilent.pdf (2021).
  29. Report Generator User Guide Agilent Seahorse XF Cell Mito Stress Test. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/Report_Generator_User_Guide_Seahorse_XF_Cell_Mito_Stress_Test_Single_File.pdf (2021).
  30. Agilent Seahorse XF Buffer Factor Protocol. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/usermanual-xf-buffer-factor-protocol-cell-analysis-S7888-10010en-agilent.pdf (2021).
  31. Agilent sensor cartridges and cell culture microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991-8657EN_seahorse_plastics_brochure.pdf (2021).
  32. Agilent Seahorse XF Glycolysis Stress Test Kit User Guide. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/XF_Glycolysis_Stress_Test_Kit_User_Guide.pdf (2021).
  33. Fan, Y. Y. A bioassay to measure energy metabolism in mouse colonic crypts, organoids, and sorted stem cells. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309, 1-9 (2015).
  34. Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell- and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
  35. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  36. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (10), 3890-3895 (2006).
  37. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2014).
  38. Corso-Diaz, X., et al. Genome-wide profiling identifies DNA methylation signatures of aging in rod photoreceptors associated with alterations in energy metabolism. Cell Reports. 31 (3), 107525 (2020).
  39. Berkowitz, B. A., et al. Mitochondrial respiration in outer retina contributes to light-evoked increase in hydration in vivo. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (15), 5957-5964 (2018).
  40. Joyal, J. S., et al. Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1. Nature Medicine. 22 (4), 439-445 (2016).

Tags

Nevrovitenskap utgave 174
Bestemmelse av mitokondrie respirasjon og glykolyse i <em>Ex Vivo</em> retinal vevsprøver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop,… More

Jiang, K., Nellissery, J., Swaroop, A. Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples. J. Vis. Exp. (174), e62914, doi:10.3791/62914 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter