Bewertung des Aminosäureverbrauchs in kultivierten Knochenzellen und isolierten Knochenschäften
Summary
Dieses Protokoll stellt einen radioaktiv markierten Aminosäureaufnahmetest vor, der für die Bewertung des Aminosäureverbrauchs entweder in Primärzellen oder in isolierten Knochen nützlich ist.
Abstract
Knochenentwicklung und Homöostase sind abhängig von der Differenzierung und Aktivität knochenbildender Osteoblasten. Die Osteoblastendifferenzierung ist sequentiell durch Proliferation gekennzeichnet, gefolgt von der Proteinsynthese und schließlich der Knochenmatrixsekretion. Proliferation und Proteinsynthese erfordern eine konstante Zufuhr von Aminosäuren. Trotzdem ist sehr wenig über den Aminosäureverbrauch in Osteoblasten bekannt. Hier beschreiben wir ein sehr empfindliches Protokoll, das entwickelt wurde, um den Aminosäureverbrauch mit radioaktiv markierten Aminosäuren zu messen. Diese Methode ist optimiert, um Veränderungen in der Aminosäureaufnahme zu quantifizieren, die mit der Proliferation oder Differenzierung von Osteoblasten, Arzneimittel- oder Wachstumsfaktorbehandlungen oder verschiedenen genetischen Manipulationen verbunden sind. Wichtig ist, dass diese Methode austauschbar verwendet werden kann, um den Aminosäureverbrauch in kultivierten Zelllinien oder Primärzellen in vitro oder in isolierten Knochenschäften ex vivo zu quantifizieren. Schließlich kann unsere Methode leicht angepasst werden, um den Transport einer der Aminosäuren sowie von Glukose und anderen radioaktiv markierten Nährstoffen zu messen.
Introduction
Aminosäuren sind organische Verbindungen, die eine funktionelle Amino- (-NH2) und Carboxylgruppe (-COOH) mit einer variablen Seitenkette enthalten, die für jede Aminosäure spezifisch ist. Im Allgemeinen sind Aminosäuren als Grundbestandteil von Protein bekannt. In jüngerer Zeit wurden neuartige Anwendungen und Funktionen von Aminosäuren aufgeklärt. Zum Beispiel können einzelne Aminosäuren metabolisiert werden, um intermediäre Metaboliten zu erzeugen, die zur Bioenergetik beitragen, als enzymatische Cofaktoren fungieren, reaktive Sauerstoffspezies regulieren oder zur Synthese anderer Aminosäuren verwendet werden 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Viele Studien zeigen, dass der Aminosäurestoffwechsel für die Pluripotenz, Proliferation und Differenzierung von Zellen in verschiedenen Kontexten entscheidend ist 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblasten sind sekretorische Zellen, die die Kollagen-Typ-1-reiche extrazelluläre Knochenmatrix produzieren und sezernieren. Um hohe Proteinsyntheseraten während der Knochenbildung aufrechtzuerhalten, benötigen Osteoblasten eine konstante Versorgung mit Aminosäuren. Um diese Nachfrage zu decken, müssen Osteoblasten aktiv Aminosäuren erwerben. In Übereinstimmung damit zeigen neuere Studien die Bedeutung der Aminosäureaufnahme und des Stoffwechsels für die Osteoblastenaktivität und Knochenbildung 15,16,17,18,19,20.
Osteoblasten erwerben zelluläre Aminosäuren aus drei Hauptquellen: extrazelluläres Milieu, intrazellulärer Proteinabbau und de novo Aminosäurebiosynthese. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Bewertung der Aminosäureaufnahme aus der extrazellulären Umgebung. Die gebräuchlichsten Methoden zur Messung der Aminosäureaufnahme basieren entweder auf radioaktiv markierten (z. B. 3H oder 14C) oder schweren isotopenmarkierten (z. B. 13C) Aminosäuren. Schwere Isotopomer-Assays können die Aminosäureaufnahme und den Stoffwechsel gründlicher und sicherer analysieren, sind jedoch zeitaufwendiger und dauern mehrere Tage, da es einen Tag dauert, um Proben vorzubereiten und zu derivatisieren, und mehrere Tage, um auf dem Massenspektrometer zu analysieren, abhängig von der Anzahl der Proben21,22. Im Vergleich dazu sind radioaktiv markierte Aminosäureaufnahmetests nicht informativ über den nachgeschalteten Stoffwechsel, aber billig und relativ schnell, da sie innerhalb von 2-3 h nach Beginn des Experiments abgeschlossen werden können23,24. Hier beschreiben wir ein leicht modifizierbares Basisprotokoll zur Bewertung der radioaktiv markierten Aminosäureaufnahme in kultivierten Primärzellen oder Zelllinien in vitro oder einzelnen Knochenschäften ex vivo. Die Anwendung dieser beiden Protokolle kann auf andere radioaktiv markierte Aminosäuren und andere knochenassoziierte Zelltypen und Gewebe ausgedehnt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hierin beschriebene Protokoll bietet einen schnellen und sensitiven Ansatz zur Bewertung der Aminosäureaufnahme als Reaktion auf verschiedene experimentelle Permutationen entweder in vitro oder ex vivo. Im Vergleich zu handelsüblichen Kits (z. B. Glutamine and Glutamate Determination Kit) ist diese Methode viel empfindlicher, schneller und weniger arbeitsintensiv16,17,25. In unserem Protokoll bewerten wir…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Karner-Labor wird durch R01-Zuschüsse des National Institute of Health (AR076325 und AR071967) an C.M.K.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
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