Этот протокол представляет собой радиоактивный анализ поглощения аминокислот, который полезен для оценки потребления аминокислот либо в первичных клетках, либо в изолированных костях.
Развитие костей и гомеостаза зависит от дифференцировки и активности костеобразующих остеобластов. Дифференцировка остеобластов последовательно характеризуется пролиферацией, за которой следует синтез белка и, в конечном счете, секреция костного матрикса. Пролиферация и синтез белка требуют постоянного поступления аминокислот. Несмотря на это, очень мало известно о потреблении аминокислот в остеобластах. Здесь мы описываем очень чувствительный протокол, который предназначен для измерения потребления аминокислот с использованием радиомаркированных аминокислот. Этот метод оптимизирован для количественной оценки изменений в поглощении аминокислот, которые связаны с пролиферацией или дифференцировкой остеобластов, медикаментозным лечением или лечением фактора роста или различными генетическими манипуляциями. Важно отметить, что этот метод может быть использован взаимозаменяемо для количественной оценки потребления аминокислот в культивируемых клеточных линиях или первичных клетках in vitro или в изолированных костных стволах ex vivo. Наконец, наш метод может быть легко адаптирован для измерения транспорта любой из аминокислот, а также глюкозы и других радиоактивных меток питательных веществ.
Аминокислоты представляют собой органические соединения, которые содержат амино (-NH2) и карбоксильные (-COOH) функциональные группы с переменной боковой цепью, специфичной для каждой аминокислоты. В целом, аминокислоты хорошо известны как основная составляющая белка. Совсем недавно были выяснены новые применения и функции аминокислот. Например, отдельные аминокислоты могут метаболизироваться с образованием промежуточных метаболитов, которые способствуют биоэнергетике, функционируют как ферментативные кофакторы, регулируют активные формы кислорода или используются для синтеза других аминокислот 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Многие исследования показывают, что метаболизм аминокислот имеет решающее значение для плюрипотентности клеток, пролиферации и дифференцировки в различных контекстах 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Остеобласты являются секреторными клетками, которые производят и секретируют коллаген типа 1, богатый внеклеточным костным матриксом. Чтобы поддерживать высокие темпы синтеза белка во время формирования костей, остеобласты требуют постоянного предложения аминокислот. Чтобы удовлетворить этот спрос, остеобласты должны активно приобретать аминокислоты. В соответствии с этим, недавние исследования показывают важность поглощения аминокислот и метаболизма в активности остеобластов и формировании костей 15,16,17,18,19,20.
Остеобласты приобретают клеточные аминокислоты из трех основных источников: внеклеточной среды, внутриклеточной деградации белка и биосинтеза аминокислот de novo. Этот протокол будет сосредоточен на оценке поглощения аминокислот из внеклеточной среды. Наиболее распространенные методы измерения поглощения аминокислот основаны либо на радиомаркированных (например, 3H или 14C), либо на тяжелых изотопах, меченных (например, 13C) аминокислотах. Тяжелые изотопомерные анализы могут анализировать поглощение и метаболизм аминокислот более тщательно и безопасно, но занимают более много времени, чтобы завершить несколько дней, поскольку требуется день для подготовки и дериватизации образцов и несколько дней для анализа на масс-спектрометре в зависимости от количества образцов21,22. Для сравнения, радиоактивные анализы поглощения аминокислот не информативны о последующем метаболизме, но являются дешевыми и относительно быстрыми, будучи в состоянии быть завершенными в течение 2-3 ч с начала эксперимента23,24. Здесь мы описываем легко модифицируемый базовый протокол, предназначенный для оценки поглощения радиоактивными аминокислотами в культивируемых первичных клетках или клеточных линиях in vitro или отдельных костных стволах ex vivo. Применение этих двух протоколов может быть распространено на другие меченые радиоактивными аминокислотами и другими типами клеток и тканей, связанных с костями.
Протокол, описанный в настоящем описании, обеспечивает быстрый и чувствительный подход к оценке поглощения аминокислот в ответ на различные экспериментальные перестановки либо in vitro, либо ex vivo. По сравнению с коммерчески доступными наборами (например, Glutamine и Glutamate Determination Kit), ?…
The authors have nothing to disclose.
Лаборатория Карнера поддерживается грантами Национального института здравоохранения R01 (AR076325 и AR071967) для C.M.K.
0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
12-well plate | Corning | 3513 | |
1mL syringe | BD precision | 309628 | |
30G Needle | BD precision | 305106 | |
Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
Beckman LS6500 scintillation counter | |||
Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
choline chloride | Sigma | C7077 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
DPBS | Gibco | 14190 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
MEMα | Gibco | 12561 | |
Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
NP-40 | Sigma | 492016 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
sodium chloride | Sigma | S9888 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
Tris Base | Sigma | 648311 | |
Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |