Evaluación del consumo de aminoácidos en células óseas cultivadas y tallos óseos aislados
Summary
Este protocolo presenta un ensayo de captación de aminoácidos radiomarcado, que es útil para evaluar el consumo de aminoácidos en células primarias o en huesos aislados.
Abstract
El desarrollo óseo y la homeostasis dependen de la diferenciación y la actividad de los osteoblastos formadores de hueso. La diferenciación de osteoblastos se caracteriza secuencialmente por la proliferación seguida de la síntesis de proteínas y, en última instancia, la secreción de la matriz ósea. La proliferación y la síntesis de proteínas requieren un suministro constante de aminoácidos. A pesar de esto, se sabe muy poco sobre el consumo de aminoácidos en los osteoblastos. Aquí describimos un protocolo muy sensible que está diseñado para medir el consumo de aminoácidos utilizando aminoácidos radiomarcados. Este método está optimizado para cuantificar los cambios en la absorción de aminoácidos que están asociados con la proliferación o diferenciación de osteoblastos, tratamientos con medicamentos o factores de crecimiento, o diversas manipulaciones genéticas. Es importante destacar que este método se puede utilizar indistintamente para cuantificar el consumo de aminoácidos en líneas celulares cultivadas o células primarias in vitro o en ejes óseos aislados ex vivo. Finalmente, nuestro método se puede adaptar fácilmente para medir el transporte de cualquiera de los aminoácidos, así como la glucosa y otros nutrientes radiomarcados.
Introduction
Los aminoácidos son compuestos orgánicos que contienen un grupo funcional amino (-NH2) y carboxilo (-COOH) con una cadena lateral variable que es específica para cada aminoácido. En general, los aminoácidos son bien conocidos como el constituyente básico de la proteína. Más recientemente, se han dilucidado nuevos usos y funciones de los aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos individuales pueden metabolizarse para generar metabolitos intermedios que contribuyen a la bioenergética, funcionan como cofactores enzimáticos, regulan las especies reactivas de oxígeno o se utilizan para sintetizar otros aminoácidos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Muchos estudios demuestran que el metabolismo de los aminoácidos es crítico para la pluripotencia, proliferación y diferenciación celular en diversos contextos 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Los osteoblastos son células secretoras que producen y secretan la matriz ósea extracelular rica en colágeno tipo 1. Para mantener altas tasas de síntesis de proteínas durante la formación ósea, los osteoblastos exigen un suministro constante de aminoácidos. Para satisfacer esta demanda, los osteoblastos deben adquirir activamente aminoácidos. De acuerdo con esto, estudios recientes revelan la importancia de la absorción de aminoácidos y el metabolismo en la actividad de los osteoblastos y la formación ósea 15,16,17,18,19,20.
Los osteoblastos adquieren aminoácidos celulares de tres fuentes principales: medio extracelular, degradación de proteínas intracelulares y biosíntesis de aminoácidos de novo. Este protocolo se centrará en la evaluación de la absorción de aminoácidos del entorno extracelular. Los métodos más comunes para medir la absorción de aminoácidos se basan en aminoácidos radiomarcados (por ejemplo, 3H o 14C) o marcados con isótopos pesados (por ejemplo, 13C). Los ensayos de isotopómeros pesados pueden analizar la absorción y el metabolismo de aminoácidos de manera más exhaustiva y segura, pero requieren más tiempo y tardan varios días en completarse, ya que se tarda un día en preparar y derivar muestras y varios días en analizarlas en el espectrómetro de masas dependiendo del número de muestras21,22. En comparación, los ensayos de captación de aminoácidos radiomarcados no son informativos sobre el metabolismo posterior, pero son baratos y relativamente rápidos, pudiendo completarse dentro de las 2-3 h desde el inicio del experimento23,24. Aquí, describimos un protocolo básico fácilmente modificable diseñado para evaluar la absorción de aminoácidos radiomarcados en células primarias cultivadas o líneas celulares in vitro o ejes óseos individuales ex vivo. La aplicación de estos dos protocolos puede extenderse a otros aminoácidos radiomarcados y otros tipos de células y tejidos asociados al hueso.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito en este documento proporciona un enfoque rápido y sensible para evaluar la absorción de aminoácidos en respuesta a diversas permutaciones experimentales, ya sea in vitro o ex vivo. En comparación con los kits disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit de determinación de glutamina y glutamato), este método es mucho más sensible, más rápido y menos laborioso16,17,25. En nuestr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El laboratorio Karner cuenta con el apoyo de subvenciones R01 del Instituto Nacional de Salud (AR076325 y AR071967) a C.M.K.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
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