JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

角膜創傷治癒を研究するための上皮擦過傷モデル

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63112
, , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center,Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスの中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコルが記載されている。この角膜創傷治癒モデルは非常に再現性が高く、現在、疾患の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。

Abstract

角膜は視力に不可欠であり、眼の屈折力の約3分の2を占める。視力における角膜の役割に不可欠なのは、その透明性です。しかし、その外的位置のために、角膜は角膜の透明度の喪失および最終的な失明につながる可能性のある多種多様な傷害に非常に敏感である。これらの傷害に応答した効率的な角膜創傷治癒は、角膜恒常性を維持し、角膜透明度および屈折能力の保存にとって極めて重要である。角膜創傷治癒が損なわれた場合、角膜は感染症、潰瘍形成、および瘢痕化に対して脆弱になる。角膜の透明性および視力の維持に対する角膜創傷治癒の基本的な重要性を考えると、正常な角膜創傷治癒プロセスのより良い理解は、感染および疾患に関連する角膜創傷治癒障害を理解するための前提条件である。この目標に向けて、角膜創傷のマウスモデルは、正常な生理学的条件下で作動する角膜創傷治癒機構の理解を促進する上で有用であることが証明されている。ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスにおける中央角膜上皮擦過傷を作成するためのプロトコルが記載されている。このモデルでは、角膜を中心とする直径2mmの円形トレフィンを使用して、創傷領域を区切る。ゴルフクラブのスパッドは、上皮をデブライドし、角膜上皮基底膜を損傷することなく円形の創傷を作成するために注意して使用される。結果として生じる炎症反応は、効率的な創傷治癒に不可欠な細胞および分子事象の十分に特徴付けられたカスケードとして進行する。この単純な角膜創傷治癒モデルは非常に再現性が高く、よく知られており、現在、疾患の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。

Introduction

角膜は、眼の3分の1の透明な前部である。角膜は、眼の内部構造を保護し、感染から眼を保護する構造障壁を形成することを含むいくつかの機能を果たす1。さらに重要なことに、角膜は視力にとって重要であり、眼2,3の屈折力の約3分の2を提供する。視力における角膜の役割に不可欠なのは、その透明性です。しかし、その外側の位置のために、角膜は、その障壁機能の破壊、透明性の喪失、および最終的な失明につながる可能性がある日常的に多種多様な傷害にさらされる。角膜透明度の喪失は、世界中の視覚障害の主な原因である4,5。角膜擦過傷は、緊急治療室(ER)への訪問の一般的な理由であり、ER6で提示された眼関連症例の半分を占める。米国では、毎年100万人以上の人々が眼に関連する怪我に苦しんでいると推定されています7。これらの傷害に応答した効率的な角膜創傷治癒は、角膜恒常性を維持し、その透明性および屈折能力の維持にとって極めて重要である。角膜創傷治癒が損なわれた場合、角膜は感染症、潰瘍形成、および瘢痕化に対して脆弱になる8,9。また、屈折矯正手術の人気が高まっているため、角膜10に独特の外傷性課題が課せられています。角膜の透明性および視力の維持に対する角膜創傷治癒の基本的な重要性を考えると、正常な角膜創傷治癒プロセスのより良い理解は、感染および疾患に関連する角膜創傷治癒障害を理解するための前提条件である。

そのために、角膜創傷治癒のいくつかの動物モデルが開発されている11、12、13、14、15。角膜創傷治癒のマウスモデルは、正常な生理学的条件下で作動する角膜創傷治癒機構の理解を促進する上で有用であることが証明されている。異なるタイプの角膜創傷が角膜創傷治癒の研究に用いられており、それぞれが創傷治癒プロセスの異なる側面を調査するのに適している。角膜創傷治癒研究に使用される創傷モデルの一般的なタイプは、機械的および化学的創傷モデルである。化学的角膜創傷は、主に角膜上のアルカリ性火傷の生成を伴い、角膜潰瘍、不透明化、および新生血管形成の研究に有用である13。機械的角膜創傷は、デブリードマン(abrasion)創傷およびケラテクトミー創傷14、15、16を含む。無傷または破れた角膜上皮基底膜は、それぞれデブリードマンおよびケラテクトミー創傷を定義する。デブリードマン創傷では、上皮基底膜は無傷のままであり、一方、ケラテクトミー創傷では、基底膜は主に前間質への浸透で破られる。デブリードマン創傷は、再上皮化、上皮細胞増殖、免疫応答、および角膜創傷後の神経再生を研究するのに最も有用である。一方、ケラテクトミー創傷は、角膜瘢痕の研究に最も有用である14,15。

ここでは、トレフィンと鈍いゴルフクラブスパッドとを用いてマウスの中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコルが記載されている。この単純な角膜創傷治癒モデルは、再現性が高く、よく公表されており、現在、疾患17の文脈における妥協した角膜創傷治癒を評価するために使用されている。

Protocol

すべての動物プロトコルは、ヒューストン大学とベイラー医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。視覚および眼科研究における動物の使用に関する視覚および眼科研究のための協会(ARVO)の声明に概説されたガイドラインは、マウスの取り扱いおよび使用において従った。 1. 準備 フルオレセイン溶液の調製 1mLの滅菌?…

Representative Results

図3 は、鈍いゴルフクラブスパッドで作成された角膜創傷の透過型電子顕微鏡写真を示し、上皮基底膜が損傷後に実際に無傷であることを実証する。 図3:上皮基底膜は角膜擦過後も無傷のままである。 鈍いゴルフクラブスパッ…

Discussion

この方法論文の目的は、トレフィンおよび鈍いゴルフクラブスパッドを用いてマウスにおいて中央角膜上皮擦過傷創傷を作成するためのプロトコールを記述することであった。このマウスモデルは、角膜炎症および創傷治癒へのその寄与を研究するために使用されている。このタイプのモデルは、正常な生理学的条件下でおよび病状における角膜創傷治癒機構を研究するために使用すること?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

資金提供: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S., および R.E.R., P.R.E.), P30EY007551 (A.R.B.), および Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.) の後援:コンテンツは著者の責任であり、国立衛生研究所(Sigma Xi)の公式見解を表すものではありません。

Materials

Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -. S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat’s licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Keywords: Epithelial AbrasionCorneal Wound HealingCorneal InflammationCorneal Wounding ModelFluorescein StainingWound ClosureRe-epithelializationImage Analysis
check_url/fr/63112?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image