JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

نموذج التآكل الظهاري لدراسة التئام جروح القرنية

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63112
, , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center,Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

هنا ، يتم وصف بروتوكول لإنشاء جرح تآكل ظهاري مركزي للقرنية في الفأر باستخدام تريفين وسبود نادي غولف حاد. نموذج التئام جروح القرنية هذا قابل للتكرار بشكل كبير ويتم استخدامه الآن لتقييم التئام جروح القرنية المعرضة للخطر في سياق الأمراض.

Abstract

القرنية أمر بالغ الأهمية للرؤية ، حيث تمثل حوالي ثلثي القوة الانكسارية للعين. من الأمور الحاسمة لدور القرنية في الرؤية شفافيتها. ومع ذلك ، نظرا لموقعها الخارجي ، فإن القرنية عرضة بشدة لمجموعة واسعة من الإصابات التي يمكن أن تؤدي إلى فقدان شفافية القرنية والعمى في نهاية المطاف. يعد التئام جروح القرنية الفعال استجابة لهذه الإصابات أمرا محوريا للحفاظ على توازن القرنية والحفاظ على شفافية القرنية وقدراتها الانكسارية. في حالات التئام جروح القرنية المعرضة للخطر ، تصبح القرنية عرضة للعدوى والتقرحات والندوب. نظرا للأهمية الأساسية لتئام جروح القرنية للحفاظ على شفافية القرنية ورؤيتها ، فإن الفهم الأفضل لعملية التئام جروح القرنية الطبيعية هو شرط أساسي لفهم ضعف التئام جروح القرنية المرتبط بالعدوى والمرض. ولتحقيق هذا الهدف، أثبتت نماذج الفئران لجرح القرنية فائدتها في تعزيز فهمنا لآليات التئام جروح القرنية التي تعمل في ظل الظروف الفسيولوجية العادية. هنا ، يتم وصف بروتوكول لإنشاء تآكل ظهاري القرنية المركزي في الفأر باستخدام تريفين و spud نادي الغولف حاد. في هذا النموذج، يتم استخدام تريفين دائري قطره 2 مم، يتمركز فوق القرنية، لترسيم منطقة الجرح. يستخدم سبود نادي الغولف بعناية لإزالة الظهارة وإنشاء جرح دائري دون الإضرار بالغشاء السفلي الظهاري للقرنية. تستمر الاستجابة الالتهابية الناتجة كسلسلة مميزة جيدا من الأحداث الخلوية والجزيئية التي تعتبر حاسمة لالتئام الجروح بكفاءة. هذا النموذج البسيط لالتئام جروح القرنية قابل للتكرار بشكل كبير ومنشور بشكل جيد ويتم استخدامه الآن لتقييم التئام جروح القرنية للخطر في سياق المرض.

Introduction

القرنية هي ثلث العين الأمامي الشفاف. تخدم القرنية العديد من الوظائف بما في ذلك حماية الهياكل الداخلية للعين وتشكيل حاجز هيكلي يحمي العين من العدوى1. الأهم من ذلك ، القرنية أمر بالغ الأهمية للرؤية ، حيث توفر حوالي ثلثي القوة الانكسارية للعين 2,3. من الأمور الحاسمة لدور القرنية في الرؤية شفافيتها. ومع ذلك ، بسبب موقعها الخارجي ، تتعرض القرنية لمجموعة واسعة من الإصابات على أساس يومي يمكن أن تؤدي إلى تعطيل وظيفة الحاجز ، وفقدان الشفافية ، والعمى في نهاية المطاف. فقدان شفافية القرنية هو السبب الرئيسي لضعف البصر في جميع أنحاء العالم 4,5. سحجات القرنية هي سبب شائع للزيارات إلى غرفة الطوارئ (ER) ، وهو ما يمثل نصف الحالات المتعلقة بالعين المقدمة في ER6. تشير التقديرات إلى أن أكثر من 1 مليون شخص يعانون من إصابات مرتبطة بالعين سنويا في الولايات المتحدة7. يعد التئام جروح القرنية بكفاءة استجابة لهذه الإصابات أمرا محوريا للحفاظ على توازن القرنية والحفاظ على شفافيتها وقدراتها الانكسارية. في حالات التئام جروح القرنية المعرضة للخطر ، تصبح القرنية عرضة للعدوى والتقرحات والندوب 8,9. أيضا ، فإن الشعبية المتزايدة للجراحات الانكسارية تضع تحديا صادما فريدا على القرنية10. نظرا للأهمية الأساسية لتئام جروح القرنية للحفاظ على شفافية القرنية ورؤيتها ، فإن الفهم الأفضل لعملية التئام جروح القرنية الطبيعية هو شرط أساسي لفهم ضعف التئام جروح القرنية المرتبط بالعدوى والمرض.

تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير العديد من النماذج الحيوانية لتئام جروح القرنية11،12،13،14،15. أثبتت نماذج مورين لالتئام جروح القرنية فائدتها في تعزيز فهمنا لآليات التئام جروح القرنية التي تعمل في ظل ظروف فسيولوجية طبيعية. تم استخدام أنواع مختلفة من جروح القرنية في دراسة التئام جروح القرنية، كل منها مناسب للتحقيق في جوانب مختلفة من عملية التئام الجروح. الأنواع الأكثر شيوعا من نماذج الجروح المستخدمة في دراسات التئام جروح القرنية هي نماذج الجروح الميكانيكية والكيميائية. جروح القرنية الكيميائية ، التي تنطوي في الغالب على إنشاء حروق قلوية على القرنية ، مفيدة لدراسة قرحة القرنية ، والعتامة ، والأوعية الدموية الجديدة13. تشمل جروح القرنية الميكانيكية جروح التنضير (التآكل) وجروح استئصال القرنية14،15،16. يحدد الغشاء السفلي الظهاري للقرنية السليم أو المخترق جروح التنضير واستئصال القرنية ، على التوالي. في جروح التنضير ، يبقى الغشاء السفلي الظهاري سليما ، بينما في جروح استئصال القرنية ، يتم اختراق الغشاء السفلي مع الاختراق في الغالب في السدى الأمامي. جروح التنضير هي الأكثر فائدة لدراسة إعادة الظهارة ، وانتشار الخلايا الظهارية ، والاستجابة المناعية ، وتجديد الأعصاب بعد جرح القرنية. من ناحية أخرى ، فإن جروح استئصال القرنية هي الأكثر فائدة لدراسة تندب القرنية14,15.

هنا ، يتم وصف بروتوكول لإنشاء جرح تآكل ظهاري مركزي للقرنية في الفأر باستخدام تريفين وسبود نادي غولف حاد. هذا النموذج البسيط لالتئام جروح القرنية قابل للتكرار بشكل كبير ومنشور بشكل جيد ويتم استخدامه الآن لتقييم التئام جروح القرنية للخطر في سياق المرض17.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوانية من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة هيوستن وكلية بايلور للطب. تم اتباع المبادئ التوجيهية الموضحة في بيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) حول استخدام الحيوانات في أبحاث الرؤية والعيون في التعامل مع الفئران واستخ?…

Representative Results

ويبين الشكل 3 صورة مجهرية إلكترونية منقولة لجرح القرنية تم إنشاؤه باستخدام سبود نادي الغولف الحاد، مما يدل على أن الغشاء السفلي الظهاري سليم بالفعل بعد الإصابة. الشكل 3: يب?…

Discussion

كان الغرض من ورقة الأساليب هذه هو وصف بروتوكول لإنشاء جرح تآكل ظهاري مركزي للقرنية في الفأر باستخدام تريفين ونادي غولف حاد. تم استخدام نموذج الفئران هذا لدراسة التهاب القرنية ومساهمته في التئام الجروح. يمكن استخدام هذا النوع من النماذج لدراسة آليات التئام جروح القرنية في ظل الظروف الفسيو…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

التمويل: بدعم من: NIH EY018239 (A.R.B.، C.W.S.، و R.E.R.)، P30EY007551 (A.R.B.)، ومنحة سيغما شي لمساعدة البحوث (P.K.A). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة ، أو سيغما شي.

Materials

Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -. S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat’s licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Epithelial AbrasionCorneal Wound HealingCorneal InflammationCorneal Wounding ModelFluorescein StainingWound ClosureRe-epithelializationImage Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image