JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Модель истирания эпителия для изучения заживления ран роговицы

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63112
, , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center,Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Здесь описан протокол создания центральной эпителиальной абразивной раны роговицы у мыши с помощью трефина и тупой клюшки для гольфа. Эта модель заживления ран роговицы обладает высокой воспроизводимостью и в настоящее время используется для оценки скомпрометированного заживления ран роговицы в контексте заболеваний.

Abstract

Роговица имеет решающее значение для зрения, составляя около двух третей преломляющей силы глаза. Решающее значение для роли роговицы в видении имеет ее прозрачность. Однако из-за своего внешнего положения роговица очень восприимчива к широкому спектру травм, которые могут привести к потере прозрачности роговицы и возможной слепоте. Эффективное заживление ран роговицы в ответ на эти травмы имеет решающее значение для поддержания гомеостаза роговицы и сохранения прозрачности роговицы и преломляющей способности. В случаях скомпрометированного заживления раны роговицы роговица становится уязвимой для инфекций, изъязвлений и рубцевания. Учитывая фундаментальную важность заживления ран роговицы для сохранения прозрачности и зрения роговицы, лучшее понимание нормального процесса заживления ран роговицы является необходимым условием для понимания нарушения заживления ран роговицы, связанного с инфекцией и болезнями. Для достижения этой цели мышиные модели ранения роговицы оказались полезными для дальнейшего понимания механизмов заживления ран роговицы, работающих в нормальных физиологических условиях. Здесь описан протокол создания центрального эпителия роговицы у мыши с помощью трефина и тупого клюшки для гольфа. В этой модели круглый трефин диаметром 2 мм, центрированный над роговицей, используется для разграничения области раны. Клюшка для гольфа используется с осторожностью для дебриции эпителия и создания круговой раны, не повреждая эпителиальную базальную мембрану роговицы. Результирующая воспалительная реакция протекает как хорошо охарактеризованный каскад клеточных и молекулярных событий, которые имеют решающее значение для эффективного заживления ран. Эта простая модель заживления ран роговицы обладает высокой воспроизводимостью и хорошо публикуется и в настоящее время используется для оценки скомпрометированного заживления ран роговицы в контексте заболевания.

Introduction

Роговица представляет собой прозрачную переднюю треть глаза. Роговица выполняет несколько функций, включая защиту внутренних структур глаза и формирование структурного барьера, который защищает глаз от инфекций1. Что еще более важно, роговица имеет решающее значение для зрения, обеспечивая около двух третей преломляющей силы глаза 2,3. Решающее значение для роли роговицы в видении имеет ее прозрачность. Однако из-за своего внешнего положения роговица ежедневно подвергается широкому спектру травм, которые могут привести к нарушению ее барьерной функции, потере прозрачности и возможной слепоте. Потеря прозрачности роговицы является основной причиной нарушения зрения во всем мире 4,5. Ссадины роговицы являются распространенной причиной посещений отделения неотложной помощи (ER), на которые приходится половина случаев, связанных с глазами, представленных в ER6. По оценкам, более 1 миллиона человек ежегодно страдают от травм глаз в Соединенных Штатах7. Эффективное заживление ран роговицы в ответ на эти травмы имеет решающее значение для поддержания гомеостаза роговицы и сохранения ее прозрачности и преломляющих способностей. В случае скомпрометированного заживления раны роговицы роговица становится уязвимой для инфекций, изъязвлений и рубцевания 8,9. Кроме того, растущая популярность рефракционных операций ставит уникальную травматическую проблему на роговицу10. Учитывая фундаментальную важность заживления ран роговицы для сохранения прозрачности и зрения роговицы, лучшее понимание нормального процесса заживления ран роговицы является необходимым условием для понимания нарушения заживления ран роговицы, связанного с инфекцией и болезнями.

С этой целью было разработано несколько животных моделей заживления ран роговицы 11,12,13,14,15. Мышиные модели заживления ран роговицы оказались полезными в дальнейшем понимании механизмов заживления ран роговицы, работающих в нормальных физиологических условиях. Различные типы ран роговицы были использованы при изучении заживления ран роговицы, каждый из которых подходит для изучения различных аспектов процесса заживления ран. Наиболее распространенными типами моделей ран, используемых в исследованиях заживления ран роговицы, являются механические и химические модели ран. Химические раны роговицы, в основном связанные с созданием щелочных ожогов на роговице, полезны для изучения язв роговицы, помутнения и неоваскуляризации13. Механические раны роговицы включают санацию (истирание) ран и кератэктомию ран 14,15,16. Неповрежденная или нарушенная эпителиальная базальная мембрана роговицы определяет санацию и кератэктомию ран соответственно. В санационных ранах эпителиальная базальная мембрана остается неповрежденной, в то время как при кератэктомии раны базальная мембрана нарушается с проникновением в основном в переднюю строму. Раны санации наиболее полезны для изучения реэпителизации, пролиферации эпителиальных клеток, иммунного ответа и регенерации нервов после ранения роговицы. Раны кератэктомии, с другой стороны, наиболее полезны для изучения рубцевания роговицы14,15.

Здесь описан протокол создания центральной эпителиальной абразивной раны роговицы у мыши с помощью трефина и тупой клюшки для гольфа. Эта простая модель заживления ран роговицы обладает высокой воспроизводимостью и хорошо публикуется и в настоящее время используется для оценки скомпрометированного заживления ран роговицы в контексте заболевания17.

Protocol

Все протоколы для животных были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию в Университете Хьюстона и Медицинском колледже Бейлора. Руководящие принципы, изложенные в заявлении Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) об испол…

Representative Results

На рисунке 3 показана просвечивающая электронная микрофотография раны роговицы, созданная тупым клубком для гольфа, демонстрирующая, что эпителиальная базальная мембрана действительно неповреждена после травмы. <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="…

Discussion

Целью данной работы по методам было описание протокола создания центральной эпителиальной абразивной раны роговицы у мыши с использованием трефина и тупой клюшки для гольфа. Эта мышиная модель была использована для изучения воспаления роговицы и его вклада в заживление ран. Данный ти…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Финансирование: При поддержке: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. и R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) и Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или Sigma Xi.

Materials

Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -. S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat’s licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Epithelial AbrasionCorneal Wound HealingCorneal InflammationCorneal Wounding ModelFluorescein StainingWound ClosureRe-epithelializationImage Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image