Un modelo de abrasión epitelial para estudiar la cicatrización de heridas corneales

Summary

Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo de cicatrización de heridas corneales es altamente reproducible y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de enfermedades.

Abstract

La córnea es crítica para la visión, ya que representa aproximadamente dos tercios del poder refractivo del ojo. Crucial para el papel de la córnea en la visión es su transparencia. Sin embargo, debido a su posición externa, la córnea es altamente susceptible a una amplia variedad de lesiones que pueden conducir a la pérdida de transparencia corneal y eventual ceguera. La cicatrización eficiente de heridas corneales en respuesta a estas lesiones es fundamental para mantener la homeostasis corneal y preservar la transparencia corneal y las capacidades refractivas. En caso de cicatrización comprometida de la herida corneal, la córnea se vuelve vulnerable a infecciones, ulceraciones y cicatrices. Dada la importancia fundamental de la cicatrización de heridas corneales para la preservación de la transparencia y la visión corneales, una mejor comprensión del proceso normal de curación de heridas corneales es un requisito previo para comprender la cicatrización deficiente de heridas corneales asociadas con infecciones y enfermedades. Hacia este objetivo, los modelos murinos de heridas corneales han demostrado ser útiles para promover nuestra comprensión de los mecanismos de curación de heridas corneales que operan en condiciones fisiológicas normales. Aquí, se describe un protocolo para crear una abrasión epitelial corneal central en ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. En este modelo, se utiliza una trefina circular de 2 mm de diámetro, centrada sobre la córnea, para demarcar el área de la herida. El palo de golf se utiliza con cuidado para desbridar el epitelio y crear una herida circular sin dañar la membrana basal epitelial corneal. La respuesta inflamatoria resultante procede como una cascada bien caracterizada de eventos celulares y moleculares que son críticos para la curación eficiente de heridas. Este modelo simple de curación de heridas corneales es altamente reproducible y bien publicado y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de la enfermedad.

Introduction

La córnea es el tercio anterior transparente del ojo. La córnea cumple varias funciones, incluida la protección de las estructuras internas del ojo y la formación de una barrera estructural que protege el ojo contra las infecciones¹. Más importante aún, la córnea es crítica para la visión, proporcionando aproximadamente dos tercios del poder refractivo del ojo ^2,3. Crucial para el papel de la córnea en la visión es su transparencia. Sin embargo, debido a su posición hacia afuera, la córnea está expuesta a una amplia variedad de lesiones en el día a día que pueden conducir a la interrupción de su función de barrera, pérdida de transparencia y eventual ceguera. La pérdida de transparencia corneal es una de las principales causas de discapacidad visual en todo el mundo ^4,5. Las abrasiones corneales son una razón común para las visitas a la sala de emergencias (ER), que representa la mitad de los casos relacionados con los ojos presentados en la ER⁶. Se estima que más de 1 millón de personas sufren lesiones relacionadas con los ojos anualmente en los Estados Unidos⁷. La cicatrización eficiente de heridas corneales en respuesta a estas lesiones es fundamental para mantener la homeostasis corneal y preservar su transparencia y capacidades refractivas. En caso de cicatrización comprometida de la herida corneal, la córnea se vuelve vulnerable a infecciones, ulceraciones y cicatrices ^8,9. Además, la creciente popularidad de las cirugías refractivas coloca un desafío traumático único en la córnea¹⁰. Dada la importancia fundamental de la cicatrización de heridas corneales para la preservación de la transparencia y la visión corneales, una mejor comprensión del proceso normal de curación de heridas corneales es un requisito previo para comprender la cicatrización deficiente de heridas corneales asociadas con infecciones y enfermedades.

Con ese fin, se han desarrollado varios modelos animales de cicatrización de heridas corneales ^{11,12,13,14,15}. Los modelos murinos de curación de heridas corneales han demostrado ser útiles para promover nuestra comprensión de los mecanismos de curación de heridas corneales que operan en condiciones fisiológicas normales. Se han empleado diferentes tipos de heridas corneales en el estudio de la cicatrización de heridas corneales, cada una adecuada para investigar diferentes aspectos del proceso de curación de heridas. Los tipos más comunes de modelos de heridas utilizados en los estudios de cicatrización de heridas corneales son los modelos de heridas mecánicas y químicas. Las heridas corneales químicas, que en su mayoría implican la creación de quemaduras alcalinas en la córnea, son útiles para estudiar las úlceras corneales, la opacificación y la neovascularización¹³. Las heridas corneales mecánicas implican heridas por desbridamiento (abrasión) y heridas por queratectomía 14,15,16. Una membrana basal epitelial corneal intacta o rota define las heridas de desbridamiento y queratectomía, respectivamente. En las heridas de desbridamiento, la membrana basal epitelial permanece intacta, mientras que en las heridas de queratectomía, la membrana basal se rompe con la penetración principalmente en el estroma anterior. Las heridas de desbridamiento son más útiles para estudiar la reepitelización, la proliferación de células epiteliales, la respuesta inmune y la regeneración nerviosa después de la herida corneal. Las heridas de queratectomía, por otro lado, son más útiles para estudiar la cicatrización corneal^14,15.

Aquí, se describe un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo simple de curación de heridas corneales es altamente reproducible y bien publicado y ahora se está utilizando para evaluar la cicatrización de heridas corneales comprometidas en el contexto de la enfermedad¹⁷.

Protocol

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Houston y Baylor College of Medicine. Las pautas descritas en la declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) sobre el uso de animales en la visión y la investigación oftálmica se siguieron en el manejo y uso de los ratones. 1. Preparación Preparación de la solución de fluoresceína <…

Representative Results

La Figura 3 muestra una micrografía electrónica de transmisión de una herida corneal creada con el palo de golf romo spud, demostrando que la membrana basal epitelial está intacta después de la lesión. Figura 3: La membrana basal epitelial permanece intacta después de la abrasión corneal. Micr…

Discussion

El propósito de este artículo de métodos fue describir un protocolo para crear una herida de abrasión epitelial corneal central en el ratón utilizando una trefina y un palo de golf romo. Este modelo murino se ha utilizado para estudiar la inflamación corneal y su contribución a la cicatrización de heridas. Este tipo de modelo se puede utilizar para estudiar los mecanismos de cicatrización de heridas corneales en condiciones fisiológicas normales y en patologías 17,28,29,41,42.^</sup…

Materials

Anti-CD31 antibody	BD Bioscience, Pharmingen	550274
Anti-CD41 antibody	BD Bioscience, Pharmingen	553847
Anti-Ly6G antibody	BD Bioscience, Pharmingen	551459
Bovine serum albumin (BSA)	ThermoFisher scientific	B14
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664
DAPI	Sigma Aldrich	D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope	GE Life Sciences
Dissecting microscope	Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale)	Fisher Scientific
Ethanol	ThermoFisher scientific	T038181000CS
Golf-club spud	Stephens instruments	S2-1135
Iris curve scissors	Fisher Scientific	31212
Isoflurane	Patterson veterinary	07-893-1389
Ketamine	Patterson veterinary	07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS)	ThermoFisher scientific	AM9624
Sodium fluorescein salt	Sigma Aldrich	46970
Surgical blade (scapel blade)	Fine Science tools	10022-00
Trephine	Integra Miltex	33-31
TritonX -100	Fisher Scientific	50-295-34
Forcep	Fine Science tools	11923-13
Xylazine	Patterson veterinary	07-808-1947