インビトロ 分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価
Summary
このプロトコルは、ヒストンシャペロンのオリゴマー化と安定性を研究するための分析サイズ排除クロマトグラフィー、ヒストンシャペロンとヒストンの相互作用を解明するためのプルダウンアッセイ、タンパク質複合体の化学量論を分析するAUC、および推定ヒストンシャペロンをin vitroで機能的に特徴付けるためのヒストンシャペロンアッセイを含む一連の方法について説明しています。
Abstract
ヒストンタンパク質はDNAと会合して真核生物のクロマチンを形成します。クロマチンの基本単位はヌクレオソームであり、コアヒストンH2A、H2B、H3、およびH4の2つのコピーからなるヒストン八量体で構成され、DNAに包まれています。八量体は、H2A/H2B二量体の2コピーとH3/H4四量体の1コピーからなる。高荷電コアヒストンは、細胞質および核内のいくつかのタンパク質と非特異的相互作用を起こしやすい。ヒストンシャペロンは、ヒストンを細胞質から核にシャトルし、DNAへの沈着を助け、ヌクレオソームの組み立てプロセスを支援する多様なクラスのタンパク質を形成します。一部のヒストンシャペロンは、H2A / H2BまたはH3 / H4のいずれかに特異的であり、一部は両方のシャペロンとして機能します。このプロトコルでは、プルダウンアッセイ、分析サイズ排除クロマトグラフィー、分析超遠心分離、ヒストンシャペロンアッセイなどの in vitro ラボ技術を組み合わせて使用して、特定のタンパク質がヒストンシャペロンとして機能するかどうかを確認する方法について説明します。
Introduction
DNAとヒストンタンパク質からなるヌクレオソームは、クロマチンの構造単位を形成し、いくつかの重要な細胞イベントを調節します。ヌクレオソームは動的に再配置および再構築され、複製、転写、翻訳などのさまざまなプロセスからDNAにアクセスできるようにします1,2。塩基性の高いヒストンは、細胞環境中の酸性タンパク質と相互作用するか、または凝集を受ける傾向があり、したがって様々な細胞欠陥をもたらす3,4,5。ヒストンシャペロンと呼ばれる専用タンパク質のグループは、細胞質から核へのヒストンの輸送を助け、異常なヒストン-DNA凝集イベントを防ぎます6,7。基本的に、ほとんどのヒストンシャペロンは、生理的イオン強度でヒストンをDNA上に貯蔵および伝達し、それによってヌクレオソームの形成を助けます8,9。一部のヒストンシャペロンは、ヒストンオリゴマーH2A / H2BまたはH3 / H410に対して明確な好みを持っています。
ヒストンシャペロンは、DNA合成に依存しない、または独立にヌクレオソームを組み立てる能力に基づいて特徴付けられる11。例えば、クロマチン集合因子-1(CAF-1)は依存的であるが、ヒストン調節因子A(HIRA)はDNA合成に依存しない12,13。同様に、ヒストンシャペロンのヌクレオプラスミンファミリーは、精子クロマチン脱凝縮およびヌクレオソーム集合に関与している14。ヌクレオソーム集合タンパク質(NAP)ファミリーのメンバーは、in vitroでのヌクレオソーム様構造の形成を促進し、細胞質と核の間のヒストンの往復に関与しています15。ヌクレオプラスミンとNAPファミリータンパク質はどちらも機能的なヒストンシャペロンですが、構造的特徴を共有していません。本質的に、単一の構造的特徴は、タンパク質をヒストンシャペロンとして分類することを可能にしない16。機能的および生物物理学的アッセイの使用と構造研究は、ヒストンシャペロンの特性評価に最適です。
この研究では、タンパク質をヌクレオソームの組み立てを助けるヒストンシャペロンとして特徴付けるための生化学的および生物物理学的方法について説明しています。まず、ヒストンシャペロンのオリゴマー状態と安定性を分析するために、分析サイズ排除クロマトグラフィーを実施しました。次に、プルダウンアッセイを実施して、ヒストンシャペロン-ヒストン相互作用の駆動力と競合性を決定しました。しかし、これらの相互作用の流体力学的パラメータは、カラム内の移動に影響を与えるタンパク質の形状とその複合体のために、分析サイズ排除クロマトグラフィーを使用して正確に計算することができませんでした。したがって、正確な分子量、相互作用の化学量論、および生体分子の形状を含む溶液中の高分子特性を提供する分析超遠心分離が使用されました。過去の研究では、yScS11617、DmACF 18、ScRTT106p19、HsNPM120などのヒストンシャペロンを機能的に特徴付けるために、in vitroヒストンシャペロンアッセイが広く使用されています。ヒストンシャペロンアッセイは、タンパク質をヒストンシャペロンとして機能的に特徴付けるためにも使用されました。
Protocol
1. ヒストンシャペロンのオリゴマー状態と安定性を解明するための分析サイズ排除クロマトグラフィー ヒストンシャペロンのオリゴマー状態の解析24 mL 分析サイズ排除クロマトグラフィー (SEC) カラムを 1.2 カラム容量 (CV)、すなわち 28.8 mL の脱気 SEC バッファー [20 mM の Tris-HCl (pH 7.5)、300 mM NaCl、および 1 mM の β-メルカプトエタノール (β-ME)] で 4 °C で平衡化します (…
Representative Results
シロイヌナズナ由来のタンパク質FKBP53の組換えN末端ヌクレオプラスミンドメインをSECの分析に供した。溶出ピーク体積を標準曲線に対してプロットし、そのオリゴマー状態を同定した。SECの分析結果から、ドメインは溶液中に五量体として存在し、分子量は約58 kDaであることが明らかになりました(図1A、B)。さらに、ヌクレオプラスミンドメインを?…
Discussion
この研究は、推定ヒストンシャペロンの生化学的および生物物理学的特性評価のための包括的なプロトコルセットを実証および検証します。本明細書では、組換え発現および精製されたNAPファミリータンパク質、AtNRP1およびAtNRP2、ならびにAtFKBP53のN末端ヌクレオプラスミンドメインを用いて、プロトコルを実証した。同じ一連の実験は、これまで特徴付けられていなかったあらゆる生物から?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
インド政府科学技術研究委員会[CRG/2018/000695/PS]およびインド政府科学技術省バイオテクノロジー省[BT/INF/22/SP33046/2019]からのディリープ・ヴァスデヴァンへの学外助成金、およびブバネシュワール生命科学研究所からの壁内支援は大いに認められています。ヒストン調製にご協力いただいたスデシュナ・センさんとアンナプルナ・サフーさんに感謝します。同僚のチンマイ・モハパトラ博士、マナス・クマール・ジャグデフ氏、シェイク・ナウサド・ホセイン博士との議論も認められています。
Materials
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
References
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Citer Cet Article
Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).