В пробирке Характеристика гистоновых шаперонов с использованием аналитических, вытягивающих и шаперонных анализов
Summary
Этот протокол описывает набор методов, которые включают аналитическую хроматографию с исключением размера для изучения олигомеризации и стабильности гистонов-шаперонов, анализ вытягивания для разгадки взаимодействий гистон-шаперон-гистон, AUC для анализа стехиометрии белковых комплексов и анализ гистонового шаперонирования для функциональной характеристики предполагаемого гистонового шаперона in vitro.
Abstract
Гистоновые белки связываются с ДНК с образованием эукариотического хроматина. Основной единицей хроматина является нуклеосома, состоящая из гистонового октамера, состоящего из двух копий основных гистонов H2A, H2B, H3 и H4, обернутых вокруг ДНК. Октамер состоит из двух копий димера H2A/H2B и одной копии тетрамера H3/H4. Высокозаряженные гистоны ядра склонны к неспецифическим взаимодействиям с несколькими белками в клеточной цитоплазме и ядре. Гистоновые шапероны образуют разнообразный класс белков, которые переносят гистоны из цитоплазмы в ядро и помогают их отложению на ДНК, тем самым помогая процессу сборки нуклеосом. Некоторые гистоновые шапероны специфичны для H2A/H2B или H3/H4, а некоторые функционируют как шапероны для обоих. Этот протокол описывает, как лабораторные методы in vitro , такие как вытягивающие анализы, аналитическая хроматография с исключением размера, аналитическое ультрацентрифугирование и анализ гистонов, могут быть использованы в тандеме для подтверждения того, функционирует ли данный белок в качестве гистонового шаперона.
Introduction
Нуклеосомы, состоящие из ДНК и гистоновых белков, образуют структурную единицу хроматина и регулируют несколько критических клеточных событий. Нуклеосомы динамически репозиционируются и реконструируются, чтобы сделать ДНК доступной для различных процессов, таких как репликация, транскрипция и трансляция 1,2. Гистоны, которые являются очень основными, либо имеют тенденцию взаимодействовать с кислыми белками в клеточной среде, либо подвергаются агрегации, что приводит к различным клеточным дефектам 3,4,5. Группа выделенных белков, называемых гистоновыми шаперонами, помогает транспорту гистонов из цитоплазмы в ядро и предотвращает аберрантные события агрегации гистон-ДНК 6,7. По сути, большинство гистоновых шаперонов хранят и переносят гистоны на ДНК с физиологической ионной силой, тем самым способствуя образованию нуклеосом 8,9. Некоторые гистоновые шапероны имеют определенное предпочтение гистоновым олигомерам H2A/H2B или H3/H410.
Гистоновые шапероны характеризуются на основе их способности собирать нуклеосомы, зависимые или независимые от синтеза ДНК11. Например, фактор сборки хроматина-1 (CAF-1) зависит, в то время как гистоновый регулятор A (HIRA) не зависит от синтеза ДНК12,13. Аналогичным образом, семейство нуклеоплазминов гистоновых шаперонов участвует в деконденсации хроматина сперматозоидов и сборке нуклеосом14. Члены семейства нуклеосомных сборочных белков (NAP) способствуют образованию нуклеосомоподобных структур in vitro и участвуют в перемещении гистонов между цитоплазмой и ядром15. Нуклеоплазмины и белки семейства NAP являются функциональными гистоновыми шаперонами, но не имеют общих структурных особенностей. По сути, ни одна структурная особенность не позволяет классифицировать белок как гистоновый шаперон16. Использование функциональных и биофизических анализов наряду со структурными исследованиями лучше всего подходит для характеристики гистоновых шаперонов.
В этой работе описываются биохимические и биофизические методы характеристики белка как гистонового шаперона, который помогает сборке нуклеосом. Сначала была проведена аналитическая размерно-эксклюзионная хроматография для анализа олигомерного статуса и стабильности гистоновых шаперонов. Затем был проведен вытягивающий анализ для определения движущих сил и конкурентного характера взаимодействий гистон-шаперон-гистон. Однако гидродинамические параметры этих взаимодействий не могут быть точно рассчитаны с помощью аналитической размерно-эксклюзионной хроматографии из-за формы белка и его комплексов, которые влияют на их миграцию через столб. Поэтому было использовано аналитическое ультрацентрифугирование, которое обеспечивает макромолекулярные свойства в растворе, которые включают точную молекулярную массу, стехиометрию взаимодействия и форму биологических молекул. В прошлых исследованиях широко использовался анализ гистонов in vitro для функциональной характеристики гистоновых шаперонов, таких как yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. Анализ гистонового шаперонирования также использовался для функциональной характеристики белков как гистоновых шаперонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа демонстрирует и подтверждает всеобъемлющий набор протоколов для биохимической и биофизической характеристики предполагаемого гистонового шаперона. При этом для демонстрации протоколов использовали рекомбинантно экспрессированные и очищенные белки семейства NAP, AtNRP1 и AtNR…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Заочные гранты Дилипу Васудевану от Совета по научным и инженерным исследованиям правительства Индии [CRG/2018/000695/PS] и Департамента биотехнологии Министерства науки и технологий правительства Индии [BT/INF/22/SP33046/2019], а также внутренняя поддержка со стороны Института наук о жизни Бхубанешвара. Мы благодарим г-жу Судешну Сен и г-жу Аннапурну Саху за их помощь в приготовлении гистонов. Приветствуются также дискуссии с нашими коллегами д-ром Чинмайи Мохапатрой, г-ном Манасом Кумаром Джагдевым и д-ром Шейхом Наусадом Хоссейном.
Materials
| Acetic acid (glacial) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamide | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument for protein purification |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor for analytical ultracentrifugation |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brilliant blue R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialysis tubing (7 kDa cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | For dialysing protein samples |
| Dithiothreitol (DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA disodium salt | MP Biomedicals | 194822 | |
| Electronic balance | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidium bromide (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | For imaging gels after staining |
| Horizontal gel electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 1704405 | Instrument for agarose gel electrophoresis |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazole | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Micropipettes | Eppendorf | Z683779 | For pipetting of micro-volumes |
| Mini-PROTEAN electrophoresis system | Bio-Rad | 1658000 | Instrument for SDS-PAGE |
| N,N-methylene-bis-acrylamide | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano drop | Thermo Fisher | ND-2000 | For measurement of protein and DNA concentrations |
| Ni-NTA agarose | Invitrogen | R901-15 | Resin beads for pull-down assay |
| Optima AUC analytical ultracentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument for analytical ultracentrifugation |
| pH Meter | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid isolation kit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid for supercoiling assay |
| Refrigerated high-speed centrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE protein marker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis | ||
| SEDNTERP | Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein | ||
| SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | For pull-down assay |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Column for analytical size-exclusion chromatography |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzyme used in plasmid supercoiling assay |
| Tris base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Urea | MP Biomedicals | 191450 | |
| Water bath | Nüve | NB 5 | For heat treatment of protein samples |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
References
- Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
- Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
- Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
- Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
- Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
- Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
- Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
- Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
- Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
- De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
- Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
- Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
- Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
- Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
- Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
- Elsässer, S. J., D’Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
- Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
- Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
- Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
- Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
- Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
- Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
- Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
- Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
- Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
- Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
- Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
- Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
- Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
- Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
- Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
- Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
- Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
- Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
- Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
- Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
- Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
- Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
- Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
- Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).
