JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimie

İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63218
, , , , , , , , ,
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology,KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry,Yale University, 5Department of Pharmacology,University of Vermont College of Medicine

Summary

Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC’yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.

Abstract

Histon proteinleri, ökaryotik kromatini oluşturmak için DNA ile birleşir. Kromatinin temel birimi, DNA tarafından sarılmış çekirdek histonları H2A, H2B, H3 ve H4’ün iki kopyasından oluşan bir histon oktamerden oluşan bir nükleozomdur. Oktamer, bir H2A / H2B dimerinin iki kopyasından ve bir H3 / H4 tetramerinin tek bir kopyasından oluşur. Yüksek yüklü çekirdek histonları, hücresel sitoplazma ve çekirdekteki çeşitli proteinlerle spesifik olmayan etkileşimlere eğilimlidir. Histon şaperonları, histonlardan çekirdeğe histonları taşıyan ve DNA üzerinde birikmelerine yardımcı olan, böylece nükleozom montaj sürecine yardımcı olan çeşitli bir protein sınıfı oluşturur. Bazı histon şaperonları H2A / H2B veya H3 / H4 için spesifiktir ve bazıları her ikisi için de şaperon olarak işlev görür. Bu protokol, pull-down testleri, analitik boyut dışlama kromatografisi, analitik ultra santrifüjleme ve histon chaperoning testi gibi in vitro laboratuvar tekniklerinin, belirli bir proteinin histon şaperonu olarak işlevsel olup olmadığını doğrulamak için birlikte nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.

Introduction

DNA ve histon proteinlerinden oluşan nükleozomlar, kromatinin yapısal birimini oluşturur ve birkaç kritik hücresel olayı düzenler. Nükleozomlar, DNA’yı replikasyon, transkripsiyon ve çeviri 1,2 gibi çeşitli süreçlere erişilebilir kılmak için dinamik olarak yeniden konumlandırılır ve yeniden şekillendirilir. Son derece bazik olan histonlar ya hücresel ortamdaki asidik proteinlerle etkileşime girme eğilimindedir ya da kümelenmeye uğrar, böylece çeşitli hücresel kusurlara yol açar 3,4,5. Histon şaperonları adı verilen bir grup özel protein, histonların sitoplazmadan çekirdeğe taşınmasına yardımcı olur ve anormal histon-DNA agregasyon olaylarını önler 6,7. Temel olarak, çoğu histon şaperonu, histonları fizyolojik iyonik güçte DNA üzerine depolar ve aktarır, böylece nükleozomların oluşumuna yardımcı olur 8,9. Bazı histon şaperonların histon oligomerleri H2A/H2B veya H3/H410 için kesin bir tercihi vardır.

Histon şaperonları, DNA sentezine bağımlı veya bağımsız nükleozomları birleştirme yeteneklerine dayanarak karakterize edilir11. Örneğin, kromatin montaj faktörü-1 (CAF-1) bağımlıyken, histon regülatörü A (HIRA) DNA sentezi 12,13’ten bağımsızdır. Benzer şekilde, histon şaperonların nükleoplazman ailesi, sperm kromatin dekondensasyonu ve nükleozom montajı14’te rol oynar. Nükleozom montaj proteini (NAP) ailesi üyeleri, in vitro nükleozom benzeri yapıların oluşumunu kolaylaştırır ve sitoplazma ile çekirdek15 arasındaki histonların kesilmesinde rol oynar. Nükleoplazminler ve NAP ailesi proteinlerin her ikisi de fonksiyonel histon şaperonlarıdır, ancak herhangi bir yapısal özelliği paylaşmaz. Temel olarak, tek bir yapısal özellik, bir proteinin histon şaperon16 olarak sınıflandırılmasına izin vermez. Fonksiyonel ve biyofiziksel testlerin yapısal çalışmalarla birlikte kullanımı, histon şaperonları karakterize etmede en iyi sonucu verir.

Bu çalışma, bir proteini nükleozom montajına yardımcı olan bir histon şaperonu olarak karakterize etmek için biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemleri açıklamaktadır. İlk olarak, histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini analiz etmek için analitik boyut dışlama kromatografisi yapıldı. Daha sonra, histon şaperon-histon etkileşimlerinin itici güçlerini ve rekabetçi doğasını belirlemek için bir pull-down testi yapıldı. Bununla birlikte, bu etkileşimlerin hidrodinamik parametreleri, proteinin şekli ve kolon boyunca göçlerini etkileyen kompleksleri nedeniyle analitik boyut dışlama kromatografisi kullanılarak doğru bir şekilde hesaplanamamıştır. Bu nedenle, doğru moleküler ağırlık, etkileşimin stokiyometrisi ve biyolojik moleküllerin şeklini içeren çözelti içi makromoleküler özellikler sağlayan analitik ultrasantrifüjleme kullanılmıştır. Geçmiş çalışmalar, yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120 gibi histon şaperonları fonksiyonel olarak karakterize etmek için in vitro histon chaperoning testini yaygın olarak kullanmıştır. Histon chaperoning testi, proteinleri histon şaperonlar olarak fonksiyonel olarak karakterize etmek için de kullanılmıştır.

Protocol

1. Histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini aydınlatmak için analitik boyut dışlama kromatografisi Histon şaperonların oligomerik durumunun analizi24 mL’lik bir analitik boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolonunu 1,2 sütun hacmi (CV), yani 28,8 mL gazdan arındırılmış SEC tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl ve 1 mM β-merkaptoetanol (β-ME)] ile 4 °C’de dengeleyin (bkz.NOT: Sütun tipi, tampon bileşimi ve tampon pH’ı, ilg…

Representative Results

Arabidopsis thaliana’dan FKBP53 proteininin rekombinant N-terminal nükleoplazmin alanı analitik SEC’e tabi tutuldu. Elüsyon tepe hacmi, oligomerik durumunu tanımlamak için standart eğriye karşı çizildi. Analitik SEC sonuçları, alanın çözelti içinde yaklaşık 58 kDa’lık bir moleküler kütleye sahip bir pentamer olarak var olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 1A, B). Ayrıca, nükleoplazmin alanı, analitik SEC ile birlikte termal ve kimyasal stabilit…

Discussion

Bu çalışma, varsayılan bir histon şaperonun biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu için kapsamlı bir protokol setini göstermekte ve doğrulamaktadır. Burada, protokolleri göstermek için rekombinant olarak eksprese edilen ve saflaştırılan NAP ailesi proteinleri, AtNRP1 ve AtNRP2 ve AtFKBP53’ün N-terminal nükleoplazman alanı kullanılmıştır. Aynı deney seti, herhangi bir organizmadan daha önce karakterize edilmemiş histon şaperonların fonksiyonel özelliklerini tanımlamak için çok iyi kul…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Hindistan Hükümeti [CRG / 2018 / 000695 / PS] ve Biyoteknoloji Bölümü, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Hindistan Hükümeti [BT / INF / 22 / SP33046 / 2019] ‘dan Dileep Vasudevan’a yapılan ekstramural hibelerin yanı sıra Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Bhubaneswar’ın intramural desteği büyük ölçüde kabul edilmektedir. Bayan Sudeshna Sen ve Bayan Annapurna Sahoo’ya histon hazırlama konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Meslektaşlarımız Dr. Chinmayee Mohapatra, Bay Manas Kumar Jagdev ve Dr. Shaikh Nausad Hossain ile yapılan görüşmeler de kabul edilmektedir.

Materials

Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D’Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111 (2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. . Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530 (2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625 (2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258 (2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809 (2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487 (2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608 (2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Tags

Keywords: Histone ChaperonesPull-down AssaysAnalytical Size Exclusion ChromatographyAnalytical Ultra-centrifugationHistone Chaperoning AssayChromatin ResearchH2A/H2B DimerH3/H4 TetramerSDS-PAGECoomassie Brilliant Blue R250Dialysis BufferAnalytical Ultra Centrifuge
check_url/fr/63218?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image