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Biochimie

In vitro Caracterización de chaperonas de histonas mediante ensayos analíticos, pull-down y acompañantes

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63218
, , , , , , , , ,
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology,KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry,Yale University, 5Department of Pharmacology,University of Vermont College of Medicine

Summary

Este protocolo describe una batería de métodos que incluye cromatografía analítica de exclusión de tamaño para estudiar la oligomerización y estabilidad de la chaperona de histonas, ensayo de extracción hacia abajo para desentrañar las interacciones chaperona-histona de histonas, AUC para analizar la estequiometría de los complejos de proteínas y ensayo de acompañamiento de histonas para caracterizar funcionalmente una chaperona de histonas putativa in vitro.

Abstract

Las proteínas histonas se asocian con el ADN para formar la cromatina eucariota. La unidad básica de la cromatina es un nucleosoma, formado por un octámero de histonas que consiste en dos copias de las histonas centrales H2A, H2B, H3 y H4, envueltas por el ADN. El octámero está compuesto por dos copias de un dímero H2A/H2B y una sola copia de un tetrámero H3/H4. Las histonas centrales altamente cargadas son propensas a interacciones no específicas con varias proteínas en el citoplasma celular y el núcleo. Las chaperonas de histonas forman una clase diversa de proteínas que transportan histonas desde el citoplasma al núcleo y ayudan a su deposición en el ADN, ayudando así al proceso de ensamblaje de nucleosomas. Algunas chaperonas de histonas son específicas para H2A/H2B o H3/H4, y algunas funcionan como chaperonas para ambas. Este protocolo describe cómo las técnicas de laboratorio in vitro , como los ensayos pull-down, la cromatografía analítica de exclusión de tamaño, la ultracentrifugación analítica y el ensayo de acompañamiento de histonas, podrían usarse en conjunto para confirmar si una proteína dada es funcional como una chaperona de histonas.

Introduction

Los nucleosomas compuestos de ADN y proteínas histonas forman la unidad estructural de la cromatina y regulan varios eventos celulares críticos. Los nucleosomas se reposicionan y remodelan dinámicamente para hacer que el ADN sea accesible a diversos procesos como la replicación, la transcripción y la traducción 1,2. Las histonas que son altamente básicas tienden a interactuar con proteínas ácidas en el medio celular o sufren agregación, lo que lleva a varios defectos celulares 3,4,5. Un grupo de proteínas dedicadas llamadas chaperonas histonas ayudan al transporte de histonas desde el citoplasma hasta el núcleo y previenen eventos aberrantes de agregación histona-ADN 6,7. Fundamentalmente, la mayoría de las chaperonas de histonas almacenan y transfieren histonas al ADN con fuerza iónica fisiológica, ayudando así a la formación de nucleosomas 8,9. Algunas chaperonas de histonas tienen una preferencia definida por los oligómeros de histonas H2A/H2B o H3/H410.

Las chaperonas de histonas se caracterizan por su capacidad para ensamblar nucleosomas dependientes o independientes de la síntesis de ADN11. Por ejemplo, el factor de ensamblaje de la cromatina-1 (CAF-1) es dependiente, mientras que el regulador de histonas A (HIRA) es independiente de la síntesis de ADN12,13. Del mismo modo, la familia de nucleoplasminas de las chaperonas histonas está involucrada en la descondensación de la cromatina espermática y el ensamblaje de nucleosomas14. Los miembros de la familia de proteínas de ensamblaje de nucleosomas (NAP) facilitan la formación de estructuras similares a nucleosomas in vitro y están involucrados en el transporte de histonas entre el citoplasma y el núcleo15. Las nucleoplasminas y las proteínas de la familia NAP son chaperonas de histonas funcionales, pero no comparten ninguna característica estructural. Esencialmente, ninguna característica estructural única permite la clasificación de una proteína como una chaperona de histonas16. El uso de ensayos funcionales y biofísicos junto con estudios estructurales funcionan mejor para caracterizar las chaperonas de histonas.

Este trabajo describe métodos bioquímicos y biofísicos para caracterizar una proteína como una chaperona de histonas que ayuda al ensamblaje de nucleosomas. En primer lugar, se realizó cromatografía analítica de exclusión de tamaño para analizar el estado oligomérico y la estabilidad de las chaperonas de histonas. A continuación, se realizó un ensayo pull-down para determinar las fuerzas impulsoras y la naturaleza competitiva de las interacciones chaperona-histona de histonas. Sin embargo, los parámetros hidrodinámicos de estas interacciones no pudieron calcularse con precisión utilizando cromatografía analítica de exclusión de tamaño debido a la forma de la proteína y sus complejos que afectan su migración a través de la columna. Por lo tanto, se utilizó la ultracentrifugación analítica, que proporciona propiedades macromoleculares en solución que incluyen el peso molecular preciso, la estequiometría de interacción y la forma de las moléculas biológicas. Estudios anteriores han utilizado ampliamente el ensayo de acompañamiento de histonas in vitro para caracterizar funcionalmente las chaperonas de histonas como yScS116 17, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120. El ensayo de acompañamiento de histonas también se utilizó para caracterizar funcionalmente las proteínas como chaperonas de histonas.

Protocol

1. Cromatografía analítica de exclusión de tamaño para dilucidar el estado oligomérico y la estabilidad de las chaperonas de histonas Análisis del estado oligomérico de las chaperonas de histonasEquilibrar una columna de cromatografía analítica de exclusión de tamaño (SEC) de 24 ml con 1,2 ml de volumen de columna (CV), es decir, 28,8 ml de tampón SEC desgasificado [20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 300 de NaCl mM y 1 mM de β-mercaptoetanol (β-ME)] a 4 °C (ver Tabla de …

Representative Results

El dominio nucleoplasmina N-terminal recombinante de la proteína FKBP53 de Arabidopsis thaliana se sometió a SEC analítico. El volumen pico de elución se trazó contra la curva estándar para identificar su estado oligomérico. Los resultados analíticos de la SEC revelaron que el dominio existe como un pentámero en solución, con una masa molecular aproximada de 58 kDa (Figura 1A, B). Además, el dominio de nucleoplasmina se analizó para determinar la estabil…

Discussion

Este trabajo demuestra y valida un conjunto completo de protocolos para la caracterización bioquímica y biofísica de una chaperona de histonas putativa. En esta invención, se utilizaron proteínas de la familia NAP expresadas y purificadas recombinantemente, AtNRP1 y AtNRP2, y el dominio de nucleoplasmina N-terminal de AtFKBP53 para demostrar los protocolos. El mismo conjunto de experimentos podría muy bien usarse para delinear los atributos funcionales de las chaperonas de histonas previamente no caracterizadas de …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Las subvenciones extramuros a Dileep Vasudevan de la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería del Gobierno de la India [CRG/2018/000695/PS] y el Departamento de Biotecnología, Ministerio de Ciencia y Tecnología del Gobierno de la India [BT/INF/22/SP33046/2019], así como el apoyo intramuros del Instituto de Ciencias de la Vida, Bhubaneswar, son muy reconocidos. Agradecemos a la Sra. Sudeshna Sen y a la Sra. Annapurna Sahoo por su ayuda con la preparación de histonas. También se reconocen las conversaciones con nuestros colegas el Dr. Chinmayee Mohapatra, el Sr. Manas Kumar Jagdev y el Dr. Shaikh Nausad Hossain.

Materials

Acetic acid (glacial) Sigma A6283
Acrylamide MP Biomedicals 814326
Agarose MP Biomedicals 193983
AKTA Pure 25M FPLC Cytiva 29018226 Instrument for protein purification
Ammonium persulfate (APS) Sigma A3678
An-60Ti rotor Beckman Coulter 361964 Rotor for analytical ultracentrifugation
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7030
Chloroform Sigma C2432
Coomassie brilliant blue R 250 Sigma 1.15444
Dialysis tubing (7 kDa cut-off) Thermo Fisher 68700 For dialysing protein samples
Dithiothreitol (DTT) MP Biomedicals 100597
DNA Loading Dye New England Biolabs B7025S
EDTA disodium salt MP Biomedicals 194822
Electronic balance Shimadzu ATX224R
Ethanol Sigma E7023
Ethidium bromide (EtBr) Sigma E8751
Gel Doc System Bio-Rad 12009077 For imaging gels after staining
Horizontal gel electrophoresis apparatus Bio-Rad 1704405 Instrument for agarose gel electrophoresis
Hydrochloric acid (HCl) Sigma 320331
Imidazole MP Biomedicals 102033
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma M8266
Micropipettes Eppendorf Z683779 For pipetting of micro-volumes
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad 1658000 Instrument for SDS-PAGE
N,N-methylene-bis-acrylamide MP Biomedicals 800172
Nano drop Thermo Fisher ND-2000 For measurement of protein and DNA concentrations
Ni-NTA agarose Invitrogen R901-15 Resin beads for pull-down assay
Optima AUC analytical ultracentrifuge Beckman Coulter B86437 Instrument for analytical ultracentrifugation
pH Meter Mettler Toledo MT30130863
Phenol Sigma P4557
Plasmid isolation kit Qiagen 27104
Proteinase K Sigma-Aldrich 1.07393
pUC19 Thermo Fisher SD0061 Plasmid for supercoiling assay
Refrigerated high-speed centrifuge Thermo Fisher 75002402
SDS-PAGE protein marker Bio-Rad 1610317
SEDFIT Free software program for analytical ultracentrifugation data analysis
SEDNTERP Free software program to estimate viscosity and density of buffer and partial specific volume of a protein
SigmaPrep Spin Columns Sigma SC1000 For pull-down assay
Sodium acetate Sigma S2889
Sodium chloride (NaCl) Merck S9888
Sodium dodecyl sulfate (SDS) MP Biomedicals 102918
Superdex 200 Increase 10/300 GL Cytiva 28990944 Column for analytical size-exclusion chromatography
Superdex 75 Increase 10/300 GL Cytiva 29148721 Column for analytical size-exclusion chromatography
TEMED Sigma 1.10732
Topoisomerase I Inspiralis WGT102 Enzyme used in plasmid supercoiling assay
Tris base Merck T1503
Tween-20 Sigma P1379
Urea MP Biomedicals 191450
Water bath Nüve NB 5 For heat treatment of protein samples
β-mercaptoethanol (β-ME) Sigma M6250
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References

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Histone ChaperonesPull-down AssaysAnalytical Size Exclusion ChromatographyAnalytical Ultra-centrifugationHistone Chaperoning AssayChromatin ResearchH2A/H2B DimerH3/H4 TetramerSDS-PAGECoomassie Brilliant Blue R250Dialysis BufferAnalytical Ultra Centrifuge

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Citer Cet Article
Bobde, R. C., Saharan, K., Baral, S., Gandhi, S., Samal, A., Sundaram, R., Kumar, A., Singh, A. K., Datta, A., Vasudevan, D. In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays. J. Vis. Exp. (178), e63218, doi:10.3791/63218 (2021).
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