בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר בידוד חריף של תאי שריר לב וכלי דם חלקים בני קיימא מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים (Danio rerio), המתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.
Abstract
דגי זברה משמשים זה זמן רב כאורגניזם מודל של בעלי חוליות בחקר הלב וכלי הדם. הקשיים הטכניים של בידוד תאים בודדים מרקמות הלב וכלי הדם של דגי הזברה מגבילים בחקר התכונות האלקטרופיזיולוגיות שלהם. שיטות קודמות תוארו עבור דיסקציה של לבבות דגי זברה ובידוד של מיוציטים לבביים חדריים. עם זאת, הבידוד של דגי זברה פרוזדורים ומיוציטים וסקולריים לאפיון אלקטרופיזיולוגי לא היה מפורט. עבודה זו מתארת פרוטוקולים אנזימטיים חדשים ומותאמים המספקים באופן שגרתי קרדיומיוציטים חדריים ופרוזדורים מבודדים של דגי זברה צעירים ובוגרים, כמו גם תאי שריר חלק וסקולרי (VSM) מהעורק הבולבוסי, המתאימים לניסויים של מהדק טלאי. לא נמצאו עדויות ספרותיות למחקרים אלקטרופיזיולוגיים על רקמות לב וכלי דם של דגי זברה שבודדו בשלבי התפתחות עובריים וזחליים. הודגמו טכניקות דיסוציאציה חלקיות המאפשרות ניסויים של מהדקי טלאים על תאים בודדים מלב זחלים ועובריים.
Introduction
דגי זברה הם דגי טלוסט קטנים המשמשים זה מכבר כאורגניזם מודל של בעלי חוליות1 ולאחרונה עלו לגדולה כמערכת בעלי חוליות בת קיימא לסינון תפוקה גבוהה של גנים ותרופות 2,3. עם זאת, ניתוח פיזיולוגי של רקמות דג זברה אינו מפותח היטב. במערכת הלב וכלי הדם תוארו שיטות לכריתה של לבבות דגי זברה4 ובידוד של מיוציטים לבביים חדריים 5,6,7. ישנם מעט תיאורים מפורטים של בידוד יעיל של מיוציטים פרוזדורים ואין דיווחים על תכשירים של שריר חלק וסקולרי (VSM) למחקרי מהדק טלאי.
העבודה הנוכחית מתארת מתודולוגיה לבידוד של מיוציטים לבביים וכלי דם של דגי זברה, בת קיימא למחקרים אלקטרופיזיולוגיים ותפקודיים. גישה זו כוללת שינויים בפרוטוקולים שדווחו בעבר לבידוד מיוציטים חדריים של דגי זברה 5,6 ומתאימה שיטות מבידודים של תאי VSM של יונקים8, מה שמאפשר בידוד של תאי שריר חלק של כלי דם של דגי זברה מה-bulbous arteriosus (BA). הפרוטוקולים מביאים לתפוקות יעילות של תאי פרוזדורים, חדרים ו-VSM מבודדים מדגי זברה, שניתן להשתמש בהם באופן אמין במחקרי מהדק טלאים עד 8 שעות9.
למרות הזחלים הכמעט שקופים שלהם המתפתחים לחלוטין מחוץ לאורגניזם ההורי, חקר הפוטנציאל האונטוגנטי המובטח שלהם בחקר התפתחות הלב וכלי הדם הוגבל על ידי אתגרים בחילוץ וניתוח רקמות בגיל צעיר. המאמר הנוכחי נותן מענה למגבלה זו על ידי הדגמת ניסויי הידוק טלאים על לבבות דגי זברה שבודדו כבר 3 ימים לאחר ההפריה (dpf), באמצעות שיטת מיצוימותאמת שפורסמה 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות קודמות לבידוד מיוציטים חדריים של דגי זברה5,6, שמטרתן ליצור מיוציטים למחקרים תרבית או אלקטרופיזיולוגיים, סיפקו תאים בעלי תפוקה נמוכה יותר וכללו שלבים ארוכים של צנטריפוגות מרובות שהשפיעו לרעה על איכות התאים ועל כדאיותם. הפרוטוקולים המתוארים כאן אמינים…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH HL140024 ל- CGN ו- HL150277 ל- CMC. איור 1 ואיור 2 נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish’s swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
