Isolamento de células musculares lisas cardíacas e vasculares de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário para estudos eletrofisiológicos
Summary
O presente protocolo descreve o isolamento agudo de células musculares lisas cardíacas e vasculares viáveis de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário (Danio rerio), adequados para estudos eletrofisiológicos.
Abstract
Os zebrafish têm sido usados há muito tempo como um modelo de organismo vertebrado em pesquisas cardiovasculares. As dificuldades técnicas de isolar células individuais dos tecidos cardiovasculares dos zebrafish têm sido limitantes no estudo de suas propriedades eletrofisiológicas. Métodos anteriores foram descritos para dissecção de corações de zebrafish e isolamento de miócitos cardíacos ventriculares. No entanto, o isolamento dos mócitos atrial e vascular de zebrafish para caracterização eletrofisiológica não foi detalhado. Este trabalho descreve protocolos enzimáticos novos e modificados que fornecem rotineiramente cardiomiocócitos ventriculares e atrials isolados, bem como células de músculo liso vascular (VSM) do arteriosus bulboso, adequados para experimentos de grampo de remendo. Não houve evidência literária de estudos eletrofisiológicos sobre tecidos cardiovasculares de zebrafish isolados em estágios embrionários e larvais de desenvolvimento. Técnicas parciais de dissociação que permitem experimentos de grampo de remendo em células individuais de corações larvais e embrionários são demonstradas.
Introduction
Zebrafish são pequenos peixes teleost que têm sido usados há muito tempo como um modelo de organismo vertebrado1 e recentemente ganharam destaque como um sistema viável de vertebrados para rastreamento de alto rendimento de genes e drogas 2,3. No entanto, a análise fisiológica dos tecidos de zebrafish não é bem desenvolvida. No sistema cardiovascular, foram descritos métodos para dissecção de corações de zebrafish4 e isolamento de miócitos cardíacos ventriculares 5,6,7. Há poucas descrições detalhadas do isolamento efetivo de miócitos atrial e nenhum relato de preparações vasculares de músculo liso (VSM) para estudos de grampo de remendo.
O trabalho atual descreve metodologia para o isolamento de mócitos cardíacos e vasculares de zebrafish, viáveis para estudos eletrofisiológicos e funcionais. Esta abordagem inclui modificações de protocolos previamente relatados para o isolamento ventricular do mócito ventricular de zebrafish 5,6 e adapta métodos de isolamento de células VSM8, permitindo o isolamento de zebrafish vascular smooth muscle cell do arteriosus bulboso (BA). Os protocolos resultam em rendimentos eficientes de células atrial, ventricular e VSM isoladas de zebrafish que podem ser usados de forma confiável em estudos de grampo de remendo por até 8 h9.
Apesar de suas larvas quase transparentes que se desenvolvem inteiramente fora do organismo parental, explorar seu potencial ongenético prometido no estudo do desenvolvimento cardiovascular tem sido limitado por desafios na extração e análise de tecidos em uma idade jovem. O artigo atual aborda essa limitação demonstrando experimentos de grampo de remendo em corações de zebrafish isolados já em 3 dias após a fertilização (dpf), utilizando um método de extração adaptado e publicado10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Métodos anteriores para isolar mócitos ventricularesde zebrafish 5,6, destinados a gerar miócitos para cultura ou estudos eletrofisiológicos, forneceram células de menor rendimento e envolveram longas etapas de múltiplas centrífugas que afetaram negativamente a qualidade e a viabilidade da célula. Os protocolos descritos aqui são confiáveis, abrangem cada um dos tecidos cardiovasculares significativos (ventrículo, atria e VSM), e, principalmente, são …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede HL140024 à CGN e HL150277 à CMC. As figuras 1 e figura 2 foram criadas com BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
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