Aislamiento de células musculares lisas cardíacas y vasculares de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios para estudios electrofisiológicos
Summary
El presente protocolo describe el aislamiento agudo de células viables del músculo liso cardíaco y vascular de peces cebra adultos, juveniles, larvales y embrionarios (Danio rerio), adecuados para estudios electrofisiológicos.
Abstract
El pez cebra se ha utilizado durante mucho tiempo como organismo vertebrado modelo en la investigación cardiovascular. Las dificultades técnicas de aislar células individuales de los tejidos cardiovasculares del pez cebra han sido limitantes en el estudio de sus propiedades electrofisiológicas. Se han descrito métodos anteriores para la disección de corazones de pez cebra y el aislamiento de miocitos cardíacos ventriculares. Sin embargo, no se detalló el aislamiento de miocitos auriculares y vasculares del pez cebra para la caracterización electrofisiológica. Este trabajo describe protocolos enzimáticos nuevos y modificados que proporcionan rutinariamente cardiomiocitos ventriculares y auriculares aislados de pez cebra juveniles y adultos, así como células de músculo liso vascular (VSM) de la arteria bulbosa, adecuadas para experimentos de patch-clamp. No ha habido evidencia literaria de estudios electrofisiológicos en tejidos cardiovasculares de pez cebra aislados en etapas embrionarias y larvales de desarrollo. Se demuestran técnicas de disociación parcial que permiten experimentos de patch-clamp en células individuales de corazones larvales y embrionarios.
Introduction
El pez cebra son pequeños peces teleósteos que se han utilizado durante mucho tiempo como organismo vertebrado modelo1 y recientemente han llegado a la prominencia como un sistema de vertebrados viable para el cribado de genes y fármacos de alto rendimiento 2,3. Sin embargo, el análisis fisiológico de los tejidos del pez cebra no está bien desarrollado. En el sistema cardiovascular, se han descrito métodos para la disección de corazones de pez cebra4 y el aislamiento de miocitos cardíacos ventriculares 5,6,7. Hay pocas descripciones detalladas del aislamiento efectivo de los miocitos auriculares y no hay informes de preparaciones de músculo liso vascular (VSM) para estudios de patch-clamp.
El presente trabajo describe la metodología para el aislamiento de miocitos cardíacos y vasculares del pez cebra, viable para estudios electrofisiológicos y funcionales. Este enfoque incluye modificaciones de protocolos previamente reportados para el aislamiento de miocitos ventriculares del pez cebra5,6 y adapta los métodos de los aislamientos de células VSM de mamíferos8, permitiendo el aislamiento de las células del músculo liso vascular del pez cebra de la arteriosa bulbosa (BA). Los protocolos dan como resultado rendimientos eficientes de células aisladas de atrial, ventricular y VSM del pez cebra que se pueden usar de manera confiable en estudios de parche y pinza hasta 8 h9.
A pesar de sus larvas casi transparentes que se desarrollan completamente fuera del organismo parental, la exploración de su potencial ontogenético prometido en el estudio del desarrollo cardiovascular se ha visto limitada por los desafíos en la extracción y el análisis de tejidos a una edad temprana. El presente artículo aborda esta limitación mediante la demostración de experimentos de patch-clamp en corazones de pez cebra aislados tan pronto como 3 días después de la fertilización (dpf), utilizando un método de extracción adaptado y publicado10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos previos para aislar miocitos ventriculares del pez cebra5,6, destinados a generar miocitos para cultivo o estudios electrofisiológicos, proporcionaron células de menor rendimiento e involucraron largos pasos de centrifugaciones múltiples que afectaron negativamente la calidad y viabilidad celular. Los protocolos descritos aquí son confiables, cubren cada uno de los tejidos cardiovasculares significativos (ventrículo, aurículas y VSM) y, lo que …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NIH HL140024 a CGN y HL150277 a CMC. La Figura 1 y la Figura 2 se crearon con BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish’s swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
