Выделение сердечных и сосудистых гладкомышечных клеток из взрослых, ювенильных, личиночных и эмбриональных рыбок данио для электрофизиологических исследований
Summary
Настоящий протокол описывает острую изоляцию жизнеспособных сердечных и сосудистых гладкомышечных клеток от взрослых, ювенильных, личиночных и эмбриональных рыбок данио (Danio rerio), пригодных для электрофизиологических исследований.
Abstract
Рыбки данио уже давно используются в качестве модели организма позвоночных в сердечно-сосудистых исследованиях. Технические трудности выделения отдельных клеток из сердечно-сосудистых тканей рыбок данио ограничивают изучение их электрофизиологических свойств. Предыдущие методы были описаны для рассечения сердца рыбок данио и выделения желудочковых сердечных миоцитов. Однако выделение предсердных и сосудистых миоцитов рыбок данио для электрофизиологической характеристики не было подробно описано. В этой работе описываются новые и модифицированные ферментативные протоколы, которые обычно обеспечивают изолированные ювенильные и взрослые желудочковые и предсердные кардиомиоциты рыбок данио, а также сосудистые гладкомышечные клетки (VSM) из луковичного артериоза, подходящие для экспериментов с зажимом пластырей. Литературных свидетельств электрофизиологических исследований сердечно-сосудистых тканей рыбок данио, выделенных на эмбриональной и личиночной стадиях развития, не имеется. Продемонстрированы методы частичной диссоциации, позволяющие проводить эксперименты с зажимом пластыря на отдельных клетках личиночного и эмбрионального сердец.
Introduction
Рыбки данио – это небольшие телеостные рыбы, которые долгое время использовались в качестве модельного организма позвоночных1 и недавно приобрели известность как жизнеспособная система позвоночных для высокопроизводительного скрининга генов и лекарств 2,3. Однако физиологический анализ тканей рыбок данио развит недостаточно. В сердечно-сосудистой системе описаны методы рассечения сердца рыбок данио4 и выделения желудочковых сердечных миоцитов 5,6,7. Существует несколько подробных описаний эффективного выделения предсердных миоцитов и нет сообщений о препаратах гладкой мускулатуры сосудов (VSM) для исследований зажимов.
В настоящей работе описана методология выделения сердечных и сосудистых миоцитов рыбок данио, жизнеспособных для электрофизиологических и функциональных исследований. Этот подход включает модификации ранее сообщенных протоколов выделения желудочковых миоцитов рыбок данио 5,6 и адаптирует методы из изоляции клеток VSM млекопитающих8, что позволяет выделять сосудистые гладкомышечные клетки рыбок данио из луковичного артериоза (БА). Протоколы приводят к эффективному выходу изолированных предсердных, желудочковых и VSM клеток рыбок данио, которые могут быть надежно использованы в исследованиях зажимов в течение 8 ч9.
Несмотря на их почти прозрачные личинки, которые развиваются полностью вне родительского организма, изучение их обещанного онтогенетического потенциала в изучении сердечно-сосудистого развития было ограничено проблемами в извлечении и анализе тканей в молодом возрасте. В настоящей статье рассматривается это ограничение путем демонстрации экспериментов с зажимом патча на сердцах рыбок данио, изолированных уже через 3 дня после оплодотворения (dpf), с использованием адаптированного, опубликованного метода экстракции10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Предыдущие методы выделения желудочковых миоцитов рыбок данио 5,6, направленные на генерацию миоцитов для культуральных или электрофизиологических исследований, обеспечивали клетки с более низким выходом и включали длительные этапы множественных центрифугаций, чт…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH HL140024 для CGN и HL150277 для CMC. Рисунки 1 и 2 были созданы с помощью BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish’s swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
