Isolement de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires pour des études électrophysiologiques
Summary
Le présent protocole décrit l’isolement aigu de cellules musculaires lisses cardiaques et vasculaires viables provenant de poissons-zèbres adultes, juvéniles, larvaires et embryonnaires (Danio rerio), adaptés aux études électrophysiologiques.
Abstract
Le poisson zèbre a longtemps été utilisé comme organisme vertébré modèle dans la recherche cardiovasculaire. Les difficultés techniques liées à l’isolement de cellules individuelles à partir des tissus cardiovasculaires du poisson zèbre ont limité l’étude de leurs propriétés électrophysiologiques. Des méthodes antérieures ont été décrites pour la dissection de cœurs de poisson zèbre et l’isolement des myocytes cardiaques ventriculaires. Cependant, l’isolement des myocytes auriculaires et vasculaires du poisson zèbre pour la caractérisation électrophysiologique n’a pas été détaillé. Ce travail décrit des protocoles enzymatiques nouveaux et modifiés qui fournissent régulièrement des cardiomyocytes ventriculaires et auriculaires juvéniles et adultes juvéniles et adultes, ainsi que des cellules vasculaires du muscle lisse (VSM) de l’artériose bulbeuse, adaptées aux expériences de patch-clamp. Il n’y a eu aucune preuve littéraire d’études électrophysiologiques sur des tissus cardiovasculaires de poisson zèbre isolés aux stades embryonnaire et larvaire du développement. Des techniques de dissociation partielle qui permettent des expériences de patch-clamp sur des cellules individuelles de cœurs larvaires et embryonnaires sont démontrées.
Introduction
Le poisson zèbre est un petit poisson téléostéen qui a longtemps été utilisé comme organisme vertébré modèle1 et qui a récemment pris de l’importance en tant que système vertébré viable pour le criblage à haut débit des gènes et des médicaments 2,3. Cependant, l’analyse physiologique des tissus du poisson zèbre n’est pas bien développée. Dans le système cardiovasculaire, des méthodes ont été décrites pour la dissection des cœurs de poisson zèbre4 et l’isolement des myocytes cardiaques ventriculaires 5,6,7. Il existe peu de descriptions détaillées de l’isolement efficace des myocytes auriculaires et aucun rapport de préparations de muscles lisses vasculaires (VSM) pour les études patch-clamp.
Les travaux actuels décrivent une méthodologie pour l’isolement des myocytes cardiaques et vasculaires du poisson zèbre, viable pour les études électrophysiologiques et fonctionnelles. Cette approche comprend des modifications des protocoles précédemment signalés pour l’isolement des myocytes ventriculaires du poisson zèbre 5,6 et adapte les méthodes à partir des isolements de cellules VSM de mammifères8, permettant l’isolement des cellules musculaires lisses vasculairesdu poisson zèbre de l’artériose bulbeuse (BA). Les protocoles permettent d’obtenir des rendements efficaces de cellules auriculaires, ventriculaires et VSM isolées provenant de poissons-zèbres qui peuvent être utilisées de manière fiable dans les études patch-clamp jusqu’à 8 h9.
Malgré leurs larves presque transparentes qui se développent entièrement en dehors de l’organisme parental, l’exploration de leur potentiel ontogénétique promis dans l’étude du développement cardiovasculaire a été limitée par les défis liés à l’extraction et à l’analyse des tissus à un jeune âge. Le présent article aborde cette limitation en démontrant des expériences de patch-clamp sur des cœurs de poissons-zèbres isolés dès 3 jours après la fécondation (dpf), en utilisant une méthode d’extraction adaptéeet publiée 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes antérieures d’isolement des myocytes ventriculaires du poisson zèbre5,6, visant à générer des myocytes pour la culture ou des études électrophysiologiques, fournissaient des cellules à faible rendement et impliquaient de longues étapes de centrifugations multiples qui nuisaient à la qualité et à la viabilité cellulaires. Les protocoles décrits ici sont fiables, couvrent chacun des tissus cardiovasculaires importants (ventricule, orei…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions NIH HL140024 à CGN et HL150277 à CMC. Les figures 1 et 2 ont été créées avec BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish’s swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
