Isolering av hjärt- och vaskulära glattmuskelceller från vuxna, juvenila, larviga och embryonala zebrafiskar för elektrofysiologiska studier
Summary
Detta protokoll beskriver den akuta isoleringen av livskraftiga hjärt- och vaskulära glattmuskelceller från vuxna, juvenila, larviska och embryonala zebrafiskar (Danio rerio), lämpliga för elektrofysiologiska studier.
Abstract
Zebrafisk har länge använts som en modell ryggradsdjur organism i kardiovaskulär forskning. De tekniska svårigheterna att isolera enskilda celler från zebrafiskens kardiovaskulära vävnader har varit begränsande för att studera deras elektrofysiologiska egenskaper. Tidigare metoder har beskrivits för dissektion av zebrafiskhjärtan och isolering av ventrikulära hjärtmyocyter. Isoleringen av zebrafiskförmaks- och vaskulära myocyter för elektrofysiologisk karakterisering var emellertid inte detaljerad. Detta arbete beskriver nya och modifierade enzymatiska protokoll som rutinmässigt tillhandahåller isolerade juvenila och vuxna zebrafiskkammare och förmakskardiomyocyter, liksom vaskulära glattmuskelceller (VSM) från bulbous arteriosus, lämpliga för patch-clamp-experiment. Det har inte funnits några litterära bevis för elektrofysiologiska studier på zebrafiskens kardiovaskulära vävnader isolerade vid embryonala och larvala utvecklingsstadier. Partiella dissociationstekniker som möjliggör patch-clamp-experiment på enskilda celler från larv- och embryonala hjärtan demonstreras.
Introduction
Zebrafisk är små teleostfiskar som länge har använts som modell ryggradsdjurorganism1 och har nyligen blivit framträdande som ett livskraftigt ryggradsdjursystem för screening med hög genomströmning av gener och läkemedel 2,3. Fysiologisk analys av zebrafiskvävnader är emellertid inte välutvecklad. I hjärt-kärlsystemet har metoder beskrivits för dissektion av zebrafiskhjärtan4 och isolering av ventrikulära hjärtmyocyter 5,6,7. Det finns få detaljerade beskrivningar av den effektiva isoleringen av förmaksmyocyter och inga rapporter om vaskulära glattmuskelpreparat (VSM) för patch-clamp-studier.
Det aktuella arbetet beskriver metodik för isolering av zebrafiskhjärtade och vaskulära myocyter, livskraftiga för elektrofysiologiska och funktionella studier. Detta tillvägagångssätt inkluderar modifieringar av tidigare rapporterade protokoll för zebrafiskventrikelmyocytisolering5,6 och anpassar metoder från däggdjurs VSM-cellisoleringar8, vilket möjliggör isolering av zebrafiskvaskulära glattmuskelceller från bulbous arteriosus (BA). Protokollen resulterar i effektiva utbyten av isolerade förmaks-, ventrikulära och VSM-celler från zebrafiskar som på ett tillförlitligt sätt kan användas i patch-clamp-studier i upp till 8 h9.
Trots deras nästan transparenta larver som utvecklas helt utanför föräldraorganismen har utforskandet av deras utlovade ontogenetiska potential för att studera kardiovaskulär utveckling begränsats av utmaningar med att extrahera och analysera vävnader i ung ålder. Den aktuella artikeln behandlar denna begränsning genom att demonstrera patch-clamp-experiment på zebrafiskhjärtan isolerade så tidigt som 3 dagar efter befruktning (dpf), med hjälp av en anpassad, publicerad extraktionsmetod10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare metoder för att isolera zebrafiskkammarmyocyter5,6, som syftade till att generera myocyter för odling eller elektrofysiologiska studier, gav celler med lägre utbyte och involverade långa steg med flera centrifugeringar som påverkade cellkvaliteten och livskraften negativt. Protokollen som beskrivs här är tillförlitliga, täcker var och en av de signifikanta kardiovaskulära vävnaderna (ventrikel, atria och VSM), och viktigare är ganska praktisk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag HL140024 till CGN och HL150277 till CMC. Figur 1 och figur 2 skapades med BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish’s swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
