Detta protokoll beskriver den akuta isoleringen av livskraftiga hjärt- och vaskulära glattmuskelceller från vuxna, juvenila, larviska och embryonala zebrafiskar (Danio rerio), lämpliga för elektrofysiologiska studier.
Zebrafisk har länge använts som en modell ryggradsdjur organism i kardiovaskulär forskning. De tekniska svårigheterna att isolera enskilda celler från zebrafiskens kardiovaskulära vävnader har varit begränsande för att studera deras elektrofysiologiska egenskaper. Tidigare metoder har beskrivits för dissektion av zebrafiskhjärtan och isolering av ventrikulära hjärtmyocyter. Isoleringen av zebrafiskförmaks- och vaskulära myocyter för elektrofysiologisk karakterisering var emellertid inte detaljerad. Detta arbete beskriver nya och modifierade enzymatiska protokoll som rutinmässigt tillhandahåller isolerade juvenila och vuxna zebrafiskkammare och förmakskardiomyocyter, liksom vaskulära glattmuskelceller (VSM) från bulbous arteriosus, lämpliga för patch-clamp-experiment. Det har inte funnits några litterära bevis för elektrofysiologiska studier på zebrafiskens kardiovaskulära vävnader isolerade vid embryonala och larvala utvecklingsstadier. Partiella dissociationstekniker som möjliggör patch-clamp-experiment på enskilda celler från larv- och embryonala hjärtan demonstreras.
Zebrafisk är små teleostfiskar som länge har använts som modell ryggradsdjurorganism1 och har nyligen blivit framträdande som ett livskraftigt ryggradsdjursystem för screening med hög genomströmning av gener och läkemedel 2,3. Fysiologisk analys av zebrafiskvävnader är emellertid inte välutvecklad. I hjärt-kärlsystemet har metoder beskrivits för dissektion av zebrafiskhjärtan4 och isolering av ventrikulära hjärtmyocyter 5,6,7. Det finns få detaljerade beskrivningar av den effektiva isoleringen av förmaksmyocyter och inga rapporter om vaskulära glattmuskelpreparat (VSM) för patch-clamp-studier.
Det aktuella arbetet beskriver metodik för isolering av zebrafiskhjärtade och vaskulära myocyter, livskraftiga för elektrofysiologiska och funktionella studier. Detta tillvägagångssätt inkluderar modifieringar av tidigare rapporterade protokoll för zebrafiskventrikelmyocytisolering5,6 och anpassar metoder från däggdjurs VSM-cellisoleringar8, vilket möjliggör isolering av zebrafiskvaskulära glattmuskelceller från bulbous arteriosus (BA). Protokollen resulterar i effektiva utbyten av isolerade förmaks-, ventrikulära och VSM-celler från zebrafiskar som på ett tillförlitligt sätt kan användas i patch-clamp-studier i upp till 8 h9.
Trots deras nästan transparenta larver som utvecklas helt utanför föräldraorganismen har utforskandet av deras utlovade ontogenetiska potential för att studera kardiovaskulär utveckling begränsats av utmaningar med att extrahera och analysera vävnader i ung ålder. Den aktuella artikeln behandlar denna begränsning genom att demonstrera patch-clamp-experiment på zebrafiskhjärtan isolerade så tidigt som 3 dagar efter befruktning (dpf), med hjälp av en anpassad, publicerad extraktionsmetod10.
Tidigare metoder för att isolera zebrafiskkammarmyocyter5,6, som syftade till att generera myocyter för odling eller elektrofysiologiska studier, gav celler med lägre utbyte och involverade långa steg med flera centrifugeringar som påverkade cellkvaliteten och livskraften negativt. Protokollen som beskrivs här är tillförlitliga, täcker var och en av de signifikanta kardiovaskulära vävnaderna (ventrikel, atria och VSM), och viktigare är ganska praktisk…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag HL140024 till CGN och HL150277 till CMC. Figur 1 och figur 2 skapades med BioRender.com.
1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
19 Guage Needle | BD | 305187 | |
2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
Elastase | Worthington | LS003118 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
Papain | Worthington | LS003118 | |
Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |