Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die akute Isolierung lebensfähiger kardialer und vaskulärer glatter Muskelzellen aus adulten, juvenilen, larven und embryonalen Zebrafischen (Danio rerio), die für elektrophysiologische Untersuchungen geeignet sind.
Abstract
Zebrafische werden seit langem als Modell-Wirbeltierorganismus in der Herz-Kreislauf-Forschung eingesetzt. Die technischen Schwierigkeiten, einzelne Zellen aus dem kardiovaskulären Gewebe des Zebrafischs zu isolieren, schränkten die Untersuchung ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften ein. Frühere Methoden wurden für die Dissektion von Zebrafischherzen und die Isolierung von ventrikulären Herzmyozyten beschrieben. Die Isolierung von Zebrafisch-Vorhof- und Gefäßmyozyten zur elektrophysiologischen Charakterisierung war jedoch nicht detailliert. Diese Arbeit beschreibt neue und modifizierte enzymatische Protokolle, die routinemäßig isolierte juvenile und adulte Zebrafisch-Ventrikel- und Vorhof-Kardiomyozyten sowie vaskuläre glatte Muskelzellen (VSM) aus dem bauchigen Arteriosus bereitstellen, die für Patch-Clamp-Experimente geeignet sind. Es gibt keine literarischen Beweise für elektrophysiologische Studien an kardiovaskulärem Gewebe von Zebrafischen, die in embryonalen und larven Entwicklungsstadien isoliert wurden. Partielle Dissoziationstechniken, die Patch-Clamp-Experimente an einzelnen Zellen aus Larven- und embryonalen Herzen ermöglichen, werden demonstriert.
Introduction
Zebrafische sind kleine Teleostfische, die seit langem als Modell-Wirbeltierorganismus1 verwendet werden und in jüngster Zeit als lebensfähiges Wirbeltiersystem für das Hochdurchsatz-Screening von Genen und Medikamenten bekannt gewordensind 2,3. Die physiologische Analyse von Zebrafischgeweben ist jedoch nicht gut entwickelt. Im kardiovaskulären System wurden Methoden zur Dissektion von Zebrafischherzen4 und zur Isolierung von ventrikulären kardialen Myozyten 5,6,7 beschrieben. Es gibt nur wenige detaillierte Beschreibungen der effektiven Isolierung von Vorhofmyozyten und keine Berichte über Präparate der glatten Vaskulärmuskulatur (VSM) für Patch-Clamp-Studien.
Die aktuelle Arbeit beschreibt Methoden zur Isolierung von Herz- und Gefäßmyozyten von Zebrafischen, die für elektrophysiologische und funktionelle Studien geeignet sind. Dieser Ansatz umfasst Modifikationen der zuvor berichteten Protokolle für die ventrikuläre Myozytenisolierung von Zebrafischen5,6 und adaptiert Methoden aus VSM-Zellisolierungen von Säugetieren8, wodurch die Isolierung von glatten Zebrafisch-Gefäßmuskelzellen aus dem bauchigen Arteriosus (BA) ermöglicht wird. Die Protokolle führen zu effizienten Ausbeuten von isolierten atrialen, ventrikulären und VSM-Zellen aus Zebrafischen, die zuverlässig in Patch-Clamp-Studien für bis zu 8 h9 verwendet werden können.
Trotz ihrer nahezu transparenten Larven, die sich vollständig außerhalb des elterlichen Organismus entwickeln, war die Erforschung ihres versprochenen ontogenetischen Potenzials bei der Untersuchung der kardiovaskulären Entwicklung durch Herausforderungen bei der Extraktion und Analyse von Geweben in jungen Jahren begrenzt. Der aktuelle Artikel befasst sich mit dieser Einschränkung, indem er Patch-Clamp-Experimente an Zebrafischherzen demonstriert, die bereits 3 Tage nach der Befruchtung (dpf) unter Verwendung einer angepassten, veröffentlichten Extraktionsmethode isoliert wurden10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frühere Methoden zur Isolierung ventrikulärer Myozyten5,6 von Zebrafischen, die darauf abzielten, Myozyten für Kultur- oder elektrophysiologische Studien zu erzeugen, lieferten Zellen mit geringerer Ausbeute und beinhalteten langwierige Schritte mehrerer Zentrifugationen, die die Zellqualität und Lebensfähigkeit beeinträchtigten. Die hier beschriebenen Protokolle sind zuverlässig, decken jedes der signifikanten kardiovaskulären Gewebe (Ventrikel, Vorhöfe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse HL140024 an CGN und HL150277 an CMC unterstützt. Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
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