Summary
Här har vi använt alizarinröd färgning för att visa att blyacetatexponering orsakar en benmassaförändring hos zebrafisklarver. Denna färgningsmetod kan anpassas till undersökningen av benförlust hos zebrafisklarver orsakad av andra farliga toxiska ämnen.
Abstract
Kemiskt inducerad benförlust på grund av bly (Pb) exponering kan utlösa en rad negativa effekter på både människors och djurs skelettsystem. De specifika effekterna och mekanismerna hos zebrafisk är dock fortfarande oklara. Alizarinrött har en hög affinitet för kalciumjoner och kan hjälpa till att visualisera benet och illustrera skelettets mineralmassa. I denna studie syftade vi till att upptäcka blyacetat (PbAc) -inducerad benförlust hos zebrafisklarver genom att använda alizarinröd färgning. Zebrafiskembryon behandlades med en serie PbAc-koncentrationer (0, 5, 10, 20 mg/L) mellan 2 och 120 timmar efter befruktning. Helmonterad skelettfärgning utfördes på larver vid 9 dagar efter befruktning, och den totala färgade ytan kvantifierades med hjälp av ImageJ-programvaran. Resultaten indikerade att de mineraliserade vävnaderna färgades i rött och det färgade området minskade signifikant i PbAc-exponeringsgruppen, med en dosberoende förändring i benmineralisering. Detta dokument presenterar ett färgningsprotokoll för att undersöka skelettförändringar i PbAc-inducerade bendefekter. Metoden kan också användas i zebrafisklarver för detektion av benförlust inducerad av andra kemikalier.
Introduction
Nya studier har bekräftat att osteoporos på grund av glukokortikoider, aromatashämmare och överdriven alkoholkonsumtion är vanligt 1,2. Bly (Pb) är en giftig metall som finns i växter, jord och vattenmiljöer3. Även om de negativa effekterna av Pb på människokroppen har väckt stor uppmärksamhet, måste dess irreversibla inverkan på benet undersökas ytterligare. Blyförgiftning orsakar en mängd olika patologiska förändringar i både det utvecklande och vuxna skelettet, vilket påverkar normala livsaktiviteter. Studier har funnit ett samband mellan kronisk Pb-exponering och benskada4, inklusive nedsatt benstruktur5,6, minskad benmineraltäthet och till och med ökad risk för osteoporos7.
Mineraliserad vävnad är av stor betydelse för benstyrka8, och benmineraliseringsmatrisavsättning är ett kritiskt index för benbildning9. Alizarinröd har en hög affinitet för kalciumjoner, och alizarinröd färgning är ett standardförfarande för bedömning av benbildning10. Enligt denna metod färgas mineraliserad vävnad röd, medan all annan vävnad förblir transparent. Det färgade området kvantifieras sedan med digital bildanalys11.
Zebrafisk är en viktig modellorganism som ofta används i läkemedelsupptäckt och sjukdomsmodeller. Genetiska studier på zebrafiskar och människor har visat likheter i de underliggande mekanismerna för skelettmorfogenes på molekylär nivå12. Dessutom är screening av läkemedel eller biomolekyler med hög genomströmning mer genomförbar i stora kopplingar av zebrafisk än murina modeller, vilket underlättar den mekanistiska studien av proosteogena eller osteotoxiska molekyler13. Differentiell färgning av skelettet i toto10 används ofta för att studera skelettdysplasi hos små ryggradsdjur och däggdjursfoster. Alizarin röd färgning utfördes för att undersöka benutvecklingstoxiciteten hos kemikalier i zebrafisklarver. Häri använde vi bly som ett exempel för att beskriva ett protokoll för att detektera blyacetatinducerade bendefekter hos zebrafisklarver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs här har granskats och godkänts av Animal Care Institute of The Ethics Committee of Soochow University.
1. Fiskhållning och embryosamling 14
- Foder fisk tre gånger varje dag; se till att zebrafisken hålls vid 28,5 ± 0,5 °C med en ljus/mörk cykel på 14:10 timmar.
- Separera den manliga och kvinnliga vuxna fisken genom isoleringsbrädor i gyttankar vid ett förhållande mellan man och kvinna på 2: 1 på kvällen.
- Nästa morgon, ta bort isoleringskorten klockan 9:00 och samla embryona 2 h senare.
- Placera embryona i en biokemisk inkubator som hålls vid 28,5 °C före experimentet.
2. Kemisk exponering
- Förbered moderbeståndet: väg blyacetattrihydrat (5 g) och lös upp det i ultrarent vatten (50 ml) under omrörning.
VARNING: PbAc är giftigt. Använd lämpliga dammmasker, skyddskläder och handskar. Utför experimentet under en dragskåp. - Välj och fördela zebrafiskembryon slumpmässigt i rena 6-brunnsplattor (30 embryon per brunn i 3 ml zebrafiskuppfödningsvatten; se tabell 1 för dess sammansättning). Behandla embryona med PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) från 2 till 120 timmar efter befruktning (hpf).
OBS: Koncentrationerna av PbAc valdes enligt dosintervallsökningsexperimenten. Resultaten visade att LC50 av blyacetat på zebrafiskembryon var 41,044 mg/L vid 120 hpf. Därför sattes den högsta koncentrationen till hälften av LC50 och en serie lösningar framställda genom 2-faldig utspädning. - Foder larverna två gånger om dagen från 5 dagar efter befruktning (dpf). Håll zebrafiskembryona vid 28,5 ± 0,5 °C med en ljus/mörk cykel på 14:10 timmar.
- Uppdatera det Pb-fria mediet (zebrafiskuppfödningsvatten) var 24: e timme till 9 dpf.
OBS: Efter avslutad experiment hälldes alla blyhaltiga lösningar i en utsedd vätsketank och behandlades av experimenthanteringscentret.
3. Alizarin röd färgning
OBS: Använd lämpliga dammmasker, skyddskläder och handskar under hela färgningsprocessen. Kompositionerna av alla lösningar visas i tabell 1.
- Specifika färgningssteg
OBS: Färgningsprocessen utfördes i en 24-brunnsplatta vid rumstemperatur. Efter att varje lösning har tillsatts, placera 24-brunnsplattan på kakbordet med låg hastighet.- Ta bort 10 zebrafisklarver slumpmässigt från varje grupp vid 9 dpf och fixera fisken i 1 ml 2% paraformaldehyd/1x fosfatbuffrad saltlösning i 2 timmar.
- Dekantera lösningen och tvätta zebrafisklarverna med 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 i 10 min.
- Dekantera lösningen och inkubera larverna i följande lösningar i 5 minuter vardera för avfärgning: vattenfri etanollösning (EtOH) (80% EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) / 10 mM MgCl2, 50% EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) och 25% EtOH / 100mM Tris-HCl (pH = 7,5).
- Dekantera lösningen, ta bort pigmentet genom blekning med en lösning bestående av 3%H2O2och 0,5% KOH och observera en gång var 10: e minut tills pigmentet är helt avlägsnat.
- Skölj zebrafisklarverna flera gånger med 25% glycerin/0,1% KOH i 10 min vardera tills det inte finns några bubblor.
OBS: Det är viktigt att undvika bubblor; Annars kommer bubblorna i zebrafiskkroppen att visas som ett svart synfält under mikroskopet, vilket kommer att påverka observationer och kvantitativ analys. - Fläcka larverna genom att blötlägga i 1 ml 0,01% alizarin i 50 min.
- Dekantera lösningen och tillsätt 1 ml 50% glycerin/0,1% KOH i 10 minuter för att rensa bakgrunden. Förvara fiskarna i färskt 50% glycerin/0,1% KOH för efterföljande observation.
4. Bildförvärv
- Överför en larva till glasskivan varje gång och håll larven i mitten av vätskedroppen.
- Observera larverna under ett stereomikroskop.
- Slå på kameran, öppna programvaran (se materialtabellen) och behåll standardinställningarna.
- Klicka på AE och välj en lämplig exponeringstid (60 ms i detta experiment) för att få den bästa bilden.
- Ta alla bilder under samma inställningar. Spara bilderna i .tif format för senare analys.
5. Bildanalys
Se tilläggsfilen för ett exempel med en uppsättning exempeldiagram för bildanalys.
- Dubbelklicka på ImageJ-ikonen och analysera bilderna som sparades i steg 4.5.
- Klicka på Arkiv | Öppna för att öppna bilderna som sparades i steg 4.5.
- Klicka på Bild | Skriv, välj 8-bitars.
- Klicka på Redigera | Invertera.
- Klicka på Analysera | Kalibrera, välj Okalibrerad OD i popup-gränssnittet, kontrollera Global kalibrering längst ned till vänster i det nedre gränssnittet och klicka på OK.
- Klicka på Analysera | Ställ in skala | Klicka för att ta bort skalan i popup-gränssnittet, markera Global nedan och klicka på OK.
- Klicka på Analysera | Ställ in mätningar, välj objektområdet i popup-gränssnittet, markera tröskelvärdet Begränsa till nedan (för att bara mäta det valda intervallet) och klicka på OK.
- Klicka på Bild | Justera| Tröskelvärde, skjut skjutreglaget mitt i popup-gränssnittet för att välja lämplig tröskel (ändra tröskeln för varje bild) så att alla mål som ska testas i en bild väljs och klicka på Ange.
- Klicka på Analysera | Mät. Anteckna datumen för varje grupp.
- Använd envägs ANOVA följt av Tukeys multipla jämförelsetest för att analysera skillnaderna och ställ in signifikansnivån på p < 0,001 (***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alizarin röd färgning är en känslig och specifik metod för att mäta förändringar i benmineralisering i zebrafisklarver. I denna studie har vi observerat att PbAc hade negativa effekter på zebrafisklarver, inklusive död, missbildning, minskad hjärtfrekvens och förkortning av kroppslängden. Dessutom utvärderades mineralskelettområdena hos zebrafisklarver för att undersöka PbAc-inducerad benförlust. Vid 9 dpf (figur 1A) mineraliseras många ben i huvudskelettet och färgas därför i rött, såsom parasfenoid (PS), operkel (OP), ceratobranchial (CB) och notochord (NC). Däremot verkar otoliter (OT) (icke-beniga strukturer) brunsvarta snarare än röda. Digital analys utfördes för att kvantifiera det totala färgade området i varje bild. Jämfört med kontrollgruppen visade blyacetatgrupper behandlade med 10 och 20 mg/l PbAc en signifikant minskning (p < 0,001) i det färgade området (figur 1B). Förändringarna i benmineralisering visade dosberoende.
Figur 1: Effekter av olika koncentrationer av PbAc på zebrafisklarver skalle . (A) Bilder av den dorsala aspekten av huvudbenet färgat med alizarinrött i larver vid 9 dpf. Den mineraliserade vävnaden är färgad i rött. Skalstänger = 0,5 mm. (B) Förändringar i relativ mineraliserad yta vid 9 dpf; 10 larver per grupp. Data uttrycks som medelvärde ± SEM. Tre replikat utfördes. p < 0,001 ***. Förkortningar: PS = parasphenoid; OP = operkel; OT = otolit; CB = ceratobranchial; NC = notochord; dpf = dagar efter befruktning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | Sammansättning | |
| Zebrafisk avelsvatten | pH 7-7,3, 27-29 °C, konduktivitet 450-550 μs, salthalt 0,25-0,75 %0, upplöst syre >6 mg/L, fotoperiod 14/10 h, hårdhet 100-200 mg/L, klor 0 mg/L, ammoniakkvävekoncentration <0,02 mg/L, nitrit <1 mg/L, nitrat <50 mg/L, koldioxid <50 mg/L | |
| Blandad lösning (50 ml) av 2% paraformaldehyd och 1x PBS | 25 ml 4% paraformaldehyd, 5 ml 10x PBS-buffert och dubbeldestillerat vatten (ddH2O) q.s. till 50 ml | |
| Blandad lösning (50 ml) av 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) och 10 mM MgCl2 | 5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7,5), 0,5 ml 1 M MgCl 2 och ddH2 O q.s. till 50 ml | |
| Blandad lösning (50 ml) av 80% vattenfri etanol, 10 mM MgCl2 och 100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) | 42,1 ml 95% vattenfri etanol, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7,5), 0,5 ml 1 M MgCl2 och ddH2O q.s. till 50 ml | |
| Blandad lösning (50 ml) av 50% vattenfri etanol och 100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) | 26,3 ml 95% vattenfri etanol, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7,5) och ddH2O q.s. till 50 ml | |
| Blandad lösning (50 ml) av 25 % vattenfri etanol och 100 mM Tris-HCl (pH=7,5) | 13,2 ml 95% vattenfri etanol, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7,5) och ddH2O q.s. till 50 ml | |
| Blandad lösning av 3%H2O2-lösningoch 0,5% KOH-lösning | Lika stora mängder 6%H2O2och 1% KOH blandat före användning | |
| Blandad lösning (50 ml) av 25% glycerin och 0,1% KOH | 12,5 ml 100% glycerin, 0,25 ml 20% KOH och ddH2O q.s. till 50 ml | |
| 0.01% Alizarin (50 ml) | 1 ml 0,5% Alizarin, 12,5 ml 100% glycerin, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7,5) och ddH2O q.s. till 50 ml | |
| Blandad lösning (50 ml) av 50% glycerin och 0,1% KOH | 25 ml 100% glycerin, 0,25 ml 20% KOH och ddH2O q.s. till 50 ml | |
Tabell 1: Sammansättning av lösningar som används i alizarinrött färgningsprotokoll. Förkortning: q.s. = kvant tillräcklig (efter behov).
Kompletterande fil: En uppsättning exempeldiagram för bildanalys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafisken är en lämplig modell för att studera benmetabolisk sjukdom. Jämfört med gnagarmodeller är zebrafiskmodeller relativt snabba att fastställa, och mätning av svårighetsgraden av sjukdomen är lättare. I zebrafisklarver av vild typ sker mineralisering av huvudskelettet vid 5 dpf och det axiella skelettet vid 7 dpf15. Således är kranialben som PS, OP, CB och NC välutvecklade vid 9 dpf. Efter att larverna var helt avfläckade och blekta rensades de mjuka vävnaderna, vilket resulterade i ett transparent utseende av fiskkroppen. Det alizarinröda färgningsreagenset tillsattes för att fläcka och visualisera mineralbenen i zebrafisk i rött.
Bildanalys är avgörande för att få tillförlitliga experimentella slutsatser i detta experiment. Fotografier av zebrafisk med god hållning och ren bakgrund valdes ut för kvantitativ analys. När vi kvantifierar det färgade området för en enda bild beräknas alla mineraliserade ben färgade i rött av en fisk. Således kan vi jämföra benmassaförändringarna mellan de blyexponerade och kontrollgrupperna. I denna studie orsakade PbAc-exponering utvecklingstoxicitet hos zebrafisk, och en signifikant minskning av det färgade området av mineralben observerades i grupperna 10 och 20 mg / L PbAc-exponering vid 9 dpf. Således minskade tidig embryonal exponering för PbAc benmassan hos zebrafisklarver. Figur 1 visar PbAc-inducerad benförlust visualiserad av alizarinröd färgning i zebrafisklarverna.
Färgämnen som binder till förkalkad matris används för att märka hela skelettet. Calcein är en fluorescerande kromofor som också specifikt kan binda till kalcium i levande vävnad och har använts för att märka benstrukturer och studera bentillväxt10. Till skillnad från kalcein genererar alizarinröd färgning av fast vävnad ett permanent register över skelettförändringar som kan underlätta jämförelser av flera prover. Mikrodatortomografi (Micro CT) kan ge exakt kvantitativ analys av mineraliserad vävnad genom att förvärva en serie 2D-röntgenstrålar. Men på grund av den lilla storleken på zebrafisk och många av benen i det utvecklande zebrafiskskelettet är tunna, kan Micro CT-analysverktyg inte exakt karakterisera dessa ben16.
Fluorescerande transgena reporterlinjer hjälper också till att visualisera skelettutveckling hos levande larver eller ännu mer mogna fiskar i realtid17. På samma sätt tillåter alizarinröd S in vivo-färgning utvärdering av levande fisk och kontinuerlig spårning av missbildningar18. Således är alizarinröd färgning ett användbart och kostnadseffektivt sätt att analysera benförlust hos zebrafisklarver. På grund av komplexiteten i de experimentella stegen och antalet lösningar som används kan de slutliga resultaten av analysen av alizarinrödfärgade bilder påverkas av experimentoperationen. Vidare är det svårt att använda denna färgningsmetod för vuxna zebrafiskar på grund av ökad kroppsvolym och mjuka vävnader; Mikro-CT-analys eller transgena linjer skulle vara ett bättre val för skelettavbildning av vuxna zebrafiskar. Sammanfattningsvis kan protokollet som presenteras här användas för att studera förändringarna i benmineralisering hos zebrafisklarver efter exponering för kemiska toxiska ämnen. Detta förfarande kan vara användbart för att etablera en zebrafiskmodell för att studera bensjukdom och utveckla nya terapeutiska läkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) och den prioriterade akademiska programutvecklingen av Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
- Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
- Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
- Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
- Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
- Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
- Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
- Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
- Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
- Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
- Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).
