Lokomotorische Bewertung des 6-Hydroxydopamin-induzierten adulten Zebrafisch-basierten Parkinson-Modells

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die intrazerebroventrikuläre (ICV) Injektion von adulten Zebrafischen mit neurotoxischem 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) am ventralen Zwischenhirn (Dn) und die Beurteilung der Beeinträchtigung und anschließenden Wiederherstellung der Nachbehandlung des Schwimmverhaltens unter Verwendung des offenen Tanktests, der von einer Analyse mit einer Video-Tracking-Software begleitet wird.

Abstract

Die Einschränkungen der derzeitigen Behandlungen bei der Verzögerung des dopaminergen neuronalen Verlusts bei der Parkinson-Krankheit (PD) erhöhen den Bedarf an alternativen Therapien, die diese Neuronen wiederherstellen können. Derzeit werden große Anstrengungen unternommen, um die Neuroregeneration anhand präklinischer In-vivo-Modelle besser zu verstehen. Diese regenerative Fähigkeit zur Selbstreparatur ist jedoch bei Säugetieren ineffizient. Nicht-Säugetiere, wie Zebrafische, haben sich daher aufgrund ihrer Fähigkeit, sich kontinuierlich selbst zu erneuern und eine enge Gehirnhomologie zum Menschen zu haben, zu einem ausgezeichneten neuroregenerativen Modell entwickelt. Im Rahmen der Bemühungen zur Aufklärung zellulärer Ereignisse, die an der Neuroregeneration in vivo beteiligt sind, haben wir das 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)-induzierte PD-Modell für erwachsene Zebrafische etabliert. Dies wurde durch die optimierte intrazerebroventrikuläre (ICV) Mikroinjektion von 99,96 mM 6-OHDA erreicht, um dopaminerge Neuronen (DpN) im ventralen Zwischenhirn (Dn) des Zebrafischgehirns spezifisch abzutragen. Immunfluoreszenz zeigte mehr als 85% der DpN-Ablation am dritten Tag nach der Läsion und die vollständige Wiederherstellung von DpN an der Läsionsstelle 30 Tage nach der Läsion. Die vorliegende Studie bestimmte die Beeinträchtigung und anschließende Erholung des Schwimmverhaltens von Zebrafischen nach einer Läsion unter Verwendung des Freifeldtests, durch den zwei Parameter, zurückgelegte Entfernung (cm) und mittlere Geschwindigkeit (cm / s), quantifiziert wurden. Die Fortbewegung wurde durch die Analyse der Aufzeichnungen einzelner Fische jeder Gruppe (n = 6) unter Verwendung einer Video-Tracking-Software bewertet. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante (p < 0,0001) Verringerung der Geschwindigkeit (cm / s) und der zurückgelegten Entfernung (cm) von läsionierten Zebrafischen 3 Tage nach der Schärfe im Vergleich zu Schein. Der mit Läsionen versehene Zebrafisch zeigte 30 Tage nach der Läsion eine vollständige Erholung des Schwimmverhaltens. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass 6-OHDA-läsionierter erwachsener Zebrafisch ein ausgezeichnetes Modell mit reproduzierbarer Qualität ist, um die Untersuchung der Neuroregeneration bei Parkinson zu erleichtern. Zukünftige Studien zu den Mechanismen, die der Neuroregeneration zugrunde liegen, sowie zu intrinsischen und extrinsischen Faktoren, die den Prozess modulieren, können wichtige Einblicke in neue Zellersatzbehandlungsstrategien gegen Parkinson liefern.

Introduction

Die Parkinson-Krankheit (PD), eine Krankheit, die durch Muskelsteifheit, Ruhetremor und Bradykinesie gekennzeichnet ist, ist die am schnellsten wachsende neurologische Erkrankung der ^Welt1,2. Das Risiko und die Prävalenz von Parkinson nehmen mit zunehmendem Alter rapide zu, insbesondere bei Personen im Alter von 50 Jahren und ^darüber3. Die Ätiologie und Pathogenese der Parkinson-Krankheit ist bisher kaum verstanden. Dies hat oft dazu geführt, dass der frühe Beginn der PD nicht diagnostiziert wurde. Gegenwärtig sind der Mangel an Dopamin und der Verlust von dopaminergen Neuronen (DpN) bei PD-Patienten stark mit der Manifestation motorischer Symptome ^verbunden4. Um diese Beziehung zu nutzen, wurden mehrere Behandlungen entwickelt, um entweder direkt als Dopaminersatz (dh Levodopa) zu wirken oder den Verlust von DpN (dh Tiefe Hirnstimulation) zu kompensieren. Obwohl diese Behandlungen symptomatische Vorteile mit sich bringen, verändern sie nicht den sich verschlechternden ^{Krankheitsverlauf5.} Angesichts dieser erheblichen Schwäche wurde eine Zellersatztherapie vorgeschlagen. Die Wirksamkeit dieses Ansatzes ist jedoch angesichts der Herausforderungen der Transplantatvorbereitung, der Zellwachstumskontrolle und der Phänotypinstabilität inkonsistent. Die Zellersatztherapie, die ethische Bedenken aufgeworfen hatte, birgt auch das Risiko, Hirntumore und unerwünschte Immunreaktionen ^{auszulösen6,7}.

Die Einschränkungen der derzeitigen therapeutischen Strategien haben dazu geführt, dass die Regeneration von DpN als potenzieller Ansatz bei der Behandlung von Parkinson stärker in den Vordergrund gerückt ist. Die Regeneration von DpN oder Neuroregeneration hat sich als einer der vielversprechenden Durchbrüche in der Behandlung von Parkinson herausgestellt, nicht nur aufgrund ihres Potenzials als neue therapeutische Methode, sondern auch als Mittel zum Verständnis des Mechanismus der ^{Krankheit8. 9}. Dieser Ansatz konzentriert sich auf die Wiederherstellung der neuronalen Funktion durch Differenzierung, Migration und Integration bestehender Vorläuferzellen in die läsionierten ^{Schaltkreise10.} Um die Neuroregeneration weiter zu erforschen, wurden verschiedene In-vivo-Studien durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass Wirbeltiere wie Säugetiere, Amphibien und Reptilien nach Verletzungen neue Gehirnzellen ^{erzeugen11,12}. Unter den Wirbeltieren sind Säugetiere aufgrund ihrer genetischen Ähnlichkeit mit dem Menschen begehrter. Säugetiere weisen jedoch eine begrenzte und schlechte Reparationskapazität im zentralen Nervensystem (ZNS) auf, die nach einer Hirnläsion bis ins Erwachsenenalter andauern ^kann13. Im Allgemeinen sind Säugetiere als Tiermodelle für das Verständnis der Neuroregeneration ungeeignet, da die geringe Anzahl der produzierten Neuronen nicht ausreicht, um beschädigte neuronale Schaltkreise, die bei PD beobachtet werden, wiederherzustellen. Daher wird das teleostbasierte Modell, insbesondere bei Zebrafischen, aufgrund seiner hohen Proliferativrate, seiner Fähigkeit, sich kontinuierlich selbst zu erneuern, und der engen Gehirnhomologie mit dem Menschen stark ^{bevorzugt14,15.}

Zebrafisch wird am häufigsten verwendet, um Bewegungsstörungen bei ^PD16 zu untersuchen. Das auf Zebrafischen basierende PD-Modell wird normalerweise durch Neurotoxine induziert, zu denen 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) und 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)¹⁷ gehören. Obwohl MPTP-basierte Modelle den spezifischen Verlust von DpN und die Abnahme des Dopaminspiegels wirksam induzieren, ahmen sie die Bedingungen von PD nicht genau nach, da der DpN-Verlust nicht ausschließlich auf das ^CNS18 beschränkt ist. Die Unfähigkeit von 6-OHDA, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, schränkte seine Auswirkungen auf zelluläre und funktionelle Veränderungen im Gehirn ein, wenn es intrakraniell verabreicht wird, im Gegensatz zu intramuskulär19^. Die periphere Verabreichung von 6-OHDA führte zu einer globalen Senkung des Dopaminspiegels im gesamten ^{Nervensystem20.} Während die Verabreichung von 6-OHDA in die Zerebrospinalflüssigkeit eine Ablation von DpN im gesamten ^ZNS21 verursachte, was nicht den Zustand nachahmt, wie er bei PD beobachtet wird, wobei der Verlust von DpN speziell an der Substantia nigra des menschlichen Gehirns auftritt. Die ICV-Verabreichung von 6-OHDA hingegen induzierte spezifisch eine signifikante Ablation von DpN im Bereich des ventralen Dn im Zebrafischgehirn, die Substantia ^nigra22 sehr ähnlich war. Interessanterweise wurde eine Erholung von DpN 30 Tage nach der 6-OHDA-induzierten Läsion berichtet und diese Neuronen überlebten im Laufe des ^Lebens23,24. Die funktionelle Erholung von DpN wurde durch eine lokomotorische Bewertung der zurückgelegten Strecke (cm) und der mittleren Geschwindigkeit (cm/s) unter Verwendung des 6-OHDA-induzierten PD-Modells für erwachsene ^{Zebrafische22} nachgewiesen.

Protocol

Die vorliegende Studie wurde vom Committee on Animal Research and Ethics (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) genehmigt [Reference No: UiTM CARE 346/2021, datiert vom 7. Mai 2021]. HINWEIS: Die veröffentlichten Protokolle22,25,26 für die Standardhaltung und Wartung des 6-OHDA-läsionierten adulten Zebrafisch-PD-Modells wurden verwendet. Die Experimente wurden mit erwachsenen männlichen Zebrafi…

Representative Results

Das vorliegende Experiment untersuchte die Veränderungen des Schwimmverhaltens erwachsener Zebrafische nach ICV-Mikroinjektion mit 6-OHDA. Der Grund für die Verwendung von 6-OHDA als Neurotoxin der Wahl lag in seiner Unfähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, was zu einer spezifischen und gezielten Ablation von DpN im Bereich des interventralen Zwischenhirns (Dn)16 führte. Die DpN-Subpopulation hat hier anatomische Ähnlichkeit mit der DpN-Subpopulation in der Substantia nigra pars <s…

Discussion

Die vorliegende Arbeit demonstrierte erfolgreich die lokomotorische Beurteilung des etablierten 6-OHDA-induzierten, adulten Zebrafisch-basierten PD-Modells. Das gesamte Experiment umfasste drei Hauptschritte: Prä-ICV-Mikroinjektionspräparate, ICV-Mikroinjektion von Zebrafischen und lokomotorische Bewertung. Um die gesunde Erholung von erwachsenen Zebrafischen nach dem ICV-Mikroinjektionsverfahren und gute experimentelle Ergebnisse zu gewährleisten, wurden in der vorliegenden Studie einige gute Praktiken für jeden Sch…

Materials

Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	162957
Ascorbic acid	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL	Thermo Fisher Scientific, California, USA	FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL	Eppendorf, Hamburg, Germany	30124332
Nice conical flask, 100 mL	Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia	SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	P4417
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	S5761
Sodium chloride	Merck, Darmstadt, Germany	106404
Stereomicroscope	Nikon, Tokyo, Japan	SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222)	Sigma-Aldrich, Missouri, USA	E10521
Equipment
ANY-maze software	Stoelting Co., Illinois, USA	–	version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance	Sartorius, Göttingen, Germany	SE 2
FemtoJet IV microinjector	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary	Eppendorf, Hamburg, Germany	5242957000
InjectMan 4 micromanipulator	Eppendorf, Hamburg, Germany	5192000027
LED Portable Lamp	MR. DIY, Selangor, Malaysia	9023251	20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips	Ted Pella, California, USA	5367-12NM
Shanda aquarium heater	Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia	SDH-228
Thermometer	Sera Precision, Heinsberg, Germany	52525
Video camera	Nikon, Tokyo, Japan	D3100