Evaluación locomotora del modelo de enfermedad de Parkinson basado en pez cebra adulto inducido por 6-hidroxidopamina
Summary
El presente protocolo describe la inyección intraerebroventricular (ICV) de pez cebra adulto con 6-hidroxidopamina neurotóxica (6-OHDA) en el diencéfalo ventral (Dn) y la evaluación del deterioro y posterior recuperación del comportamiento de natación postlesión mediante el uso de la prueba de tanque abierto, que se acompaña de análisis utilizando un software de seguimiento de video.
Abstract
Las limitaciones de los tratamientos actuales para retrasar la pérdida neuronal dopaminérgica en la enfermedad de Parkinson (EP) plantean la necesidad de terapias alternativas que puedan restaurar estas neuronas. Mucho esfuerzo se dirige actualmente hacia una mejor comprensión de la neurorregeneración utilizando modelos preclínicos in vivo . Esta capacidad regenerativa para la autorreparación es, sin embargo, ineficiente en los mamíferos. Los animales no mamíferos como el pez cebra han surgido como un excelente modelo neurorregenerativo debido a su capacidad para autorrenovarse continuamente y tener una homología cerebral cercana a los humanos. Como parte del esfuerzo para dilucidar los eventos celulares involucrados en la neuroregeneración in vivo, hemos establecido el modelo de EP basado en pez cebra adulto inducido por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Esto se logró a través de la microinyección intracerebroventricular (ICV) optimizada de 99.96 mM 6-OHDA para extirpar específicamente las neuronas dopaminérgicas (DpN) en el diencéfalo ventral (Dn) del cerebro del pez cebra. La inmunofluorescencia indicó más del 85% de la ablación de DpN en el tercer día después de la eclosión y la restauración completa de DpN en el sitio lesionado 30 días después de la agresión. El presente estudio determinó el deterioro y posterior recuperación del comportamiento de natación del pez cebra tras la lesión mediante el uso de la prueba de campo abierto a través de la cual se cuantificaron dos parámetros, la distancia recorrida (cm) y la velocidad media (cm/s). La locomoción se evaluó analizando las grabaciones de peces individuales de cada grupo (n = 6) utilizando un software de seguimiento de video. Los hallazgos mostraron una reducción significativa (p < 0,0001) en la velocidad (cm / s) y la distancia recorrida (cm) del pez cebra lesionado 3 días después de la muerte en comparación con la farsa. El pez cebra lesionado exhibió una recuperación completa del comportamiento de natación 30 días después de la recesión. Los presentes hallazgos sugieren que el pez cebra adulto lesionado 6-OHDA es un excelente modelo con calidad reproducible para facilitar el estudio de la neurorregeneración en la EP. Los estudios futuros sobre los mecanismos subyacentes a la neurorregeneración, así como los factores intrínsecos y extrínsecos que modulan el proceso pueden proporcionar información importante sobre las nuevas estrategias de tratamiento de reemplazo celular contra la EP.
Introduction
La enfermedad de Parkinson (EP), una enfermedad caracterizada distintivamente por rigidez muscular, temblor en reposo y bradicinesia, es la enfermedad neurológica de más rápido crecimiento en el mundo1,2. El riesgo y la prevalencia de EP aumentan rápidamente con la edad, especialmente en individuos de 50 años o más3. La etiología y la patogénesis de la EP hasta ahora siguen siendo poco conocidas. Esto a menudo ha dejado el inicio temprano de la EP sin diagnosticar. En la actualidad, la falta de dopamina y la pérdida de neuronas dopaminérgicas (DpN) en pacientes con EP están fuertemente ligadas a la manifestación de síntomas motores4. Aprovechando esta relación, se han diseñado varios tratamientos para actuar directamente como reemplazo de dopamina (es decir, levodopa) o para compensar la pérdida de DpN (es decir, estimulación cerebral profunda). Aunque estos tratamientos producen beneficios sintomáticos, no modifican el curso deteriorado de la enfermedad5. En vista de esta debilidad significativa, se ha propuesto la terapia de reemplazo celular. Sin embargo, la eficacia de este enfoque es inconsistente dados los desafíos de la preparación del injerto, el control del crecimiento celular y la inestabilidad del fenotipo. La terapia de reemplazo celular, que había planteado preocupaciones éticas, también plantea el riesgo de inducir tumores cerebrales y reacciones inmunes no deseadas6,7.
Las limitaciones de las estrategias terapéuticas actuales han llevado a un mayor énfasis en la regeneración de DpN como un enfoque potencial en el tratamiento de la EP. La regeneración de DpN o neuroregeneración se ha convertido en uno de los avances prometedores en el manejo de la EP, no solo debido a su potencial como nuevo método terapéutico sino también como medio para comprender el mecanismo de la enfermedad8, 9. Este enfoque se centra en la restauración de la función neuronal a través de la diferenciación, la migración y la integración de las células progenitoras existentes en los circuitos lesionados10. Con el fin de explorar más a fondo la neurorregeneración, se han llevado a cabo varios estudios in vivo. Se encontró que vertebrados como mamíferos, anfibios y reptiles generan nuevas células cerebrales después de una lesión11,12. Entre los vertebrados, los animales mamíferos son más buscados dado su parecido genético con los seres humanos. Los mamíferos, sin embargo, exhiben una capacidad reparadora limitada y pobre en el sistema nervioso central (SNC) que puede durar hasta la edad adulta después de una lesión cerebral13. En general, los mamíferos no son adecuados como modelos animales para comprender la neurorregeneración, dado que el bajo número de neuronas producidas no será suficiente para restaurar los circuitos neuronales dañados observados en la EP. Como tal, el modelo basado en teleósteos, específicamente en el pez cebra, es muy favorecido por su alta tasa proliferativa, capacidad de autorrenovación continua y estrecha homología cerebral con humanos14,15.
El pez cebra se usa más comúnmente para estudiar el movimiento desordenado en PD16. El modelo de EP basado en pez cebra generalmente es inducido por neurotoxinas, que incluyen 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) y 6-hidroxidopamina (6-OHDA)17. Aunque son efectivos para inducir la pérdida específica de DpN y la disminución de los niveles de dopamina, los modelos basados en MPTP no imitan de cerca las condiciones de la EP, ya que la pérdida de DpN no se limita únicamente al SNC18. La incapacidad del 6-OHDA para atravesar la barrera hematoencefálica restringió sus efectos sobre los cambios celulares y funcionales dentro del cerebro cuando se administra intracranealmente en lugar de intramuscular19. La administración periférica de 6-OHDA provocó una reducción global de los niveles de dopamina en todo el sistema nervioso20. Mientras que la administración de 6-OHDA en el líquido cefalorraquídeo causó la ablación de DpN en todo el SNC21, que no imita la condición como se ve en la EP por la cual la pérdida de DpN ocurre específicamente en la sustancia negra del cerebro humano. La administración de ICV de 6-OHDA, por el contrario, indujo específicamente una ablación significativa de DpN en el área de Dn ventral en el cerebro del pez cebra, que se parecía mucho a la sustancia negra22. Curiosamente, la recuperación de DpN se reportó 30 días después de la lesión inducida por 6-OHDA y estas neuronas sobrevivieron a lo largo de la vida23,24. La recuperación funcional de DpN se demostró a través de una evaluación locomotora de la distancia recorrida (cm) y la velocidad media (cm/s) utilizando el modelo PD adulto basado en pez cebra inducido por 6-OHDA22.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente trabajo demostró con éxito la evaluación locomotora del modelo de EP adulto basado en pez cebra adulto inducido por 6-OHDA. Todo el experimento involucró tres pasos principales: preparaciones de microinyección pre-ICV, microinyección ICV de pez cebra y evaluación locomotora. Para garantizar la recuperación saludable del pez cebra adulto después del procedimiento de microinyección de ICV y un buen resultado experimental, se han recomendado algunas buenas prácticas para cada paso en el presente estud…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación Superior de Malasia bajo el Programa de Becas de Investigación Fundamental [600-IRMI / FRGS 5/3 (033/2019)].
Materials
| Materials | |||
| 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
| Ascorbic acid | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
| Disposable pasteur pipette, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
| Microcentrifuge tube, 0.2 mL | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30124332 | |
| Nice conical flask, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA | – | version 7.0; video tracking software |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Göttingen, Germany | SE 2 | |
| FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000035 | |
| Femtotip II, sterile injection capillary | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242957000 | |
| InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000027 | |
| LED Portable Lamp | MR. DIY, Selangor, Malaysia | 9023251 | 20 mAh |
| PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
| Shanda aquarium heater | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
| Thermometer | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
| Video camera | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |
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