Valutazione locomotoria del modello di malattia di Parkinson a base di zebrafish adulto indotto da 6-idrossidopamina
Summary
Il presente protocollo descrive l’iniezione intracerebroventricolare (ICV) di zebrafish adulto con 6-idrossidopamina neurotossica (6-OHDA) al diencefalo ventrale (Dn) e la valutazione della compromissione e del successivo recupero del comportamento di nuoto postlesione utilizzando il test in vasca aperta, che è accompagnato da analisi utilizzando un software di tracciamento video.
Abstract
I limiti degli attuali trattamenti nel ritardare la perdita neuronale dopaminergica nella malattia di Parkinson (PD) aumentano la necessità di terapie alternative in grado di ripristinare questi neuroni. Molti sforzi sono attualmente diretti verso una migliore comprensione della neurorigenerazione utilizzando modelli preclinici in vivo . Questa capacità rigenerativa per l’autoriparazione è, tuttavia, inefficiente nei mammiferi. Gli animali non mammiferi come il pesce zebra sono così emersi come un eccellente modello neurorigenerativo grazie alla sua capacità di auto-rinnovarsi continuamente e di avere una stretta omologia cerebrale per gli esseri umani. Come parte dello sforzo per chiarire gli eventi cellulari coinvolti nella neurorigenerazione in vivo, abbiamo stabilito il modello pd a base di pesce zebra adulto indotto da 6-idrossidopamina (6-OHDA). Ciò è stato ottenuto attraverso la microiniezione intracerebroventricolare (ICV) ottimizzata di 99,96 mM 6-OHDA per ablare specificamente i neuroni dopaminergici (DpN) nel diencefalo ventrale (Dn) del cervello del pesce zebra. L’immunofluorescenza ha indicato oltre l’85% dell’ablazione di DpN al terzo giorno postlesion e il ripristino completo di DpN nel sito lesionato 30 giorni dopo la lesione. Il presente studio ha determinato la compromissione e il successivo recupero del comportamento di nuoto del pesce zebra a seguito della lesione utilizzando il test in campo aperto attraverso il quale sono stati quantificati due parametri, distanza percorsa (cm) e velocità media (cm / s). La locomozione è stata valutata analizzando le registrazioni dei singoli pesci di ciascun gruppo (n = 6) utilizzando un software di tracciamento video. I risultati hanno mostrato una significativa (p < 0,0001) riduzione della velocità (cm/ s) e della distanza percorsa (cm) del pesce zebra lesionato 3 giorni dopo la lesione rispetto allo sham. Il pesce zebra lesionato ha mostrato un pieno recupero del comportamento di nuoto 30 giorni dopo la lesione. I risultati attuali suggeriscono che il pesce zebra adulto lesionato 6-OHDA è un modello eccellente con qualità riproducibile per facilitare lo studio della neurorigenerazione nel PD. Studi futuri sui meccanismi alla base della neurorigenerazione e sui fattori intrinseci ed estrinseci che modulano il processo possono fornire importanti informazioni sulle nuove strategie di trattamento sostitutivo cellulare contro il PD.
Introduction
Il morbo di Parkinson (PD), una malattia caratterizzata in modo distintivo da rigidità muscolare, tremore a riposo e bradicinesia, è la malattia neurologica in più rapida crescita al mondo1,2. Il rischio e la prevalenza di PD aumentano rapidamente con l’età, specialmente negli individui di età pari o superiore a 50 anni3. L’eziologia e la patogenesi del PD finora rimangono poco conosciute. Questo ha spesso lasciato l’insorgenza precoce del PD non diagnosticata. Allo stato attuale, la mancanza di dopamina e la perdita di neuroni dopaminergici (DpN) nei pazienti con PD sono fortemente legate alla manifestazione dei sintomi motori4. Capitalizzando su questa relazione, diversi trattamenti sono stati progettati per agire direttamente come sostituto della dopamina (cioè levodopa) o per compensare la perdita di DpN (cioè la stimolazione cerebrale profonda). Sebbene questi trattamenti portino benefici sintomatici, non modificano il decorso deteriorante della malattia5. In considerazione di questa significativa debolezza, è stata proposta la terapia sostitutiva cellulare. L’efficacia di questo approccio è, tuttavia, incoerente date le sfide della preparazione dell’innesto, del controllo della crescita cellulare e dell’instabilità del fenotipo. La terapia sostitutiva cellulare, che aveva sollevato preoccupazioni etiche, pone anche il rischio di indurre tumori cerebrali e reazioni immunitarie indesiderate6,7.
I limiti delle attuali strategie terapeutiche hanno portato a una maggiore enfasi sulla rigenerazione del DpN come potenziale approccio nel trattamento della PD. La rigenerazione del DpN o della neurorigenerazione è emersa come una delle promettenti scoperte nella gestione del PD, non solo per il suo potenziale come nuovo metodo terapeutico, ma anche come mezzo per comprendere il meccanismo della malattia8, 9. Questo approccio si concentra sul ripristino della funzione neuronale attraverso la differenziazione, la migrazione e l’integrazione delle cellule progenitrici esistenti nei circuiti lesionati10. Al fine di esplorare ulteriormente la neurorigenerazione, sono stati intrapresi vari studi in vivo. È stato scoperto che vertebrati come mammiferi, anfibi e rettili generano nuove cellule cerebrali a seguito di lesioni11,12. Tra i vertebrati, gli animali di mammifero sono più ricercati data la loro somiglianza genetica con gli esseri umani. I mammiferi, tuttavia, mostrano una limitata e scarsa capacità riparativa nel sistema nervoso centrale (SNC) che può durare fino all’età adulta a seguito di una lesione cerebrale13. In generale, i mammiferi non sono adatti come modelli animali per comprendere la neurorigenerazione dato che il basso numero di neuroni prodotti non sarà sufficiente a ripristinare i circuiti neurali danneggiati osservati nel PD. Come tale, il modello basato sul teleosteo, in particolare nel pesce zebra, è molto favorito per il suo alto tasso proliferativo, la capacità di auto-rinnovarsi continuamente e l’omologia cerebrale ravvicinata con gli esseri umani14,15.
Zebrafish è più comunemente usato per studiare il movimento disordinato in PD16. Il modello di PD a base di zebrafish è solitamente indotto da neurotossine, che includono 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) e 6-idrossidopamina (6-OHDA)17. Sebbene efficaci nell’indurre la perdita specifica di DpN e la diminuzione dei livelli di dopamina, i modelli basati su MPTP non imitano da vicino le condizioni del PD poiché la perdita di DpN non è limitata esclusivamente al CNS18. L’incapacità del 6-OHDA di attraversare la barriera emato-encefalica ha limitato i suoi effetti sui cambiamenti cellulari e funzionali all’interno del cervello quando viene somministrato intracranicamente rispetto a quello intramuscolare19. La somministrazione periferica di 6-OHDA ha causato una riduzione globale dei livelli di dopamina in tutto il sistema nervoso20. Mentre la somministrazione di 6-OHDA nel liquido cerebrospinale ha causato l’ablazione di DpN in tutto il CNS21, che non imita la condizione come visto nel PD per cui la perdita di DpN si verifica specificamente alla substantia nigra del cervello umano. La somministrazione ICV di 6-OHDA, al contrario, ha specificamente indotto un’ablazione significativa di DpN nell’area del Dn ventrale nel cervello del pesce zebra, che assomigliava molto alla substantia nigra22. È interessante notare che il recupero di DpN è stato riportato 30 giorni dopo la lesione indotta da 6-OHDA e questi neuroni sono sopravvissuti nel corso della vita23,24. Il recupero funzionale di DpN è stato dimostrato attraverso una valutazione locomotoria della distanza percorsa (cm) e della velocità media (cm/s) utilizzando il modello PD adulto a base di zebrafish indotto da 6-OHDA22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente lavoro ha dimostrato con successo la valutazione locomotoria del modello di PD adulto a base di pesce zebra adulto indotto da 6-OHDA. L’intero esperimento ha coinvolto tre fasi principali: preparazioni di microiniezione pre-ICV, microiniezione ICV di zebrafish e valutazione locomotoria. Per garantire il sano recupero del pesce zebra adulto seguendo la procedura di microiniezione ICV e un buon risultato sperimentale, nel presente studio sono state raccomandate alcune buone pratiche per ogni fase.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell’Istruzione Superiore della Malesia nell’ambito del Fundamental Research Grant Scheme [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
Materials
| Materials | |||
| 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
| Ascorbic acid | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
| Disposable pasteur pipette, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
| Microcentrifuge tube, 0.2 mL | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30124332 | |
| Nice conical flask, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA | – | version 7.0; video tracking software |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Göttingen, Germany | SE 2 | |
| FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000035 | |
| Femtotip II, sterile injection capillary | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242957000 | |
| InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000027 | |
| LED Portable Lamp | MR. DIY, Selangor, Malaysia | 9023251 | 20 mAh |
| PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
| Shanda aquarium heater | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
| Thermometer | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
| Video camera | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |
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