Lokomotorisk vurdering af 6-hydroxydopamin-induceret voksen zebrafisk-baseret Parkinsons sygdomsmodel
Summary
Denne protokol beskriver intracerebroventrikulær (ICV) injektion af voksne zebrafisk med neurotoksisk 6-hydroxydopamin (6-OHDA) ved den ventrale diencephalon (Dn) og vurderingen af svækkelsen og efterfølgende genopretning af svømmeadfærd postlesion ved hjælp af åben tank test, som ledsages af analyse ved hjælp af en video tracking software.
Abstract
Begrænsningerne i de nuværende behandlinger i forsinkelse af dopaminerg neuronalt tab i Parkinsons sygdom (PD) øger behovet for alternative terapier, der kan genoprette disse neuroner. En stor indsats er i øjeblikket rettet mod en bedre forståelse af neuroregenerering ved hjælp af prækliniske in vivo-modeller . Denne regenerative evne til selvreparation er imidlertid ineffektiv hos pattedyr. Ikke-pattedyrsdyr som zebrafisk har således vist sig som en fremragende neuroregenerativ model på grund af dens evne til kontinuerligt at forny sig selv og have en tæt hjernehomologi til mennesker. Som en del af indsatsen for at belyse cellulære hændelser involveret i neuroregenerering in vivo har vi etableret den 6-hydroxydopamin (6-OHDA)-inducerede voksne zebrafisk-baserede PD-model. Dette blev opnået gennem den optimerede intracerebroventrikulære (ICV) mikroinjektion af 99,96 mM 6-OHDA til specifikt at ablate dopaminerge neuroner (DpN) i den ventrale diencephalon (Dn) af zebrafisk hjerne. Immunofluorescens indikerede mere end 85% af DpN-ablationen på dag tre efter og fuld restaurering af DpN på læsionsstedet 30 dage efter udslip. Den foreliggende undersøgelse fastslog svækkelsen og efterfølgende genopretning af zebrafiskens svømmeadfærd efter læsion ved hjælp af den åbne felttest, hvorigennem to parametre, tilbagelagt afstand (cm) og gennemsnitshastighed (cm / s), blev kvantificeret. Bevægelseen blev vurderet ved at analysere optagelserne af individuelle fisk i hver gruppe (n = 6) ved hjælp af videosporingssoftware. Resultaterne viste en signifikant (p < 0,0001) reduktion i hastighed (cm / s) og tilbagelagt afstand (cm) af læsioned zebrafisk 3 dage efter lesion sammenlignet med sham. Den læsionerede zebrafisk udviste fuld genopretning af svømmeadfærd 30 dage efter førelsen. De foreliggende resultater tyder på, at 6-OHDA læsionerede voksne zebrafisk er en fremragende model med reproducerbar kvalitet for at lette undersøgelsen af neuroregenerering i PD. Fremtidige undersøgelser af de mekanismer, der ligger til grund for neuroregenerering samt indre og ydre faktorer, der modulerer processen, kan give vigtig indsigt i nye celleudskiftningsbehandlingsstrategier mod PD.
Introduction
Parkinsons sygdom (PD), en sygdom, der er karakteristisk karakteriseret ved muskelstivhed, hvilende rysten og bradykinesi, er den hurtigst voksende neurologiske sygdom i verden1,2. Risikoen og forekomsten af PD stiger hurtigt med alderen, især hos personer i alderen 50 år og derover3. PD’s ætiologi og patogenese er hidtil fortsat dårligt forstået. Dette har ofte efterladt den tidlige begyndelse af PD udiagnosticeret. På nuværende tidspunkt er manglen på dopamin og tabet af dopaminerge neuroner (DpN) hos PD-patienter stærkt forbundet med manifestationen af motoriske symptomer4. Ved at udnytte dette forhold er flere behandlinger designet til enten at fungere direkte som dopaminerstatning (dvs. levodopa) eller for at kompensere for tabet af DpN (dvs. dyb hjernestimulering). Selv om disse behandlinger medfører symptomatiske fordele, ændrer de ikke sygdommens forværrede forløb5. I lyset af denne betydelige svaghed er celleerstatningsterapi blevet foreslået. Effektiviteten af denne tilgang er imidlertid inkonsekvent i betragtning af udfordringerne ved graftpræparation, cellevækstkontrol og fænotype ustabilitet. Celleerstatningsterapi, som havde rejst etiske bekymringer, udgør også risikoen for at fremkalde hjernetumorer og uønskede immunreaktioner6,7.
Begrænsningerne i de nuværende terapeutiske strategier har ført til en større vægt på regenerering af DpN som en potentiel tilgang til behandling af PD. Regenerering af DpN eller neuroregenerering har vist sig som et af de lovende gennembrud i forvaltningen af PD, ikke kun på grund af dets potentiale som en ny terapeutisk metode, men også som et middel til at forstå sygdommens mekanisme8, 9. Denne tilgang fokuserer på genoprettelsen af neuronal funktion gennem differentiering, migration og integration af eksisterende stamceller i det læsionerede kredsløb10. For yderligere at udforske neuroregenerering er der foretaget forskellige in vivo-undersøgelser. Det blev konstateret, at hvirveldyr som pattedyr, padder og krybdyr genererer nye hjerneceller efter skade11,12. Blandt hvirveldyrene er pattedyr mere eftertragtede i betragtning af deres genetiske lighed med mennesker. Pattedyr udviser imidlertid begrænset og dårlig reparativ kapacitet i centralnervesystemet (CNS), der kan vare gennem voksenalderen efter en hjernelæsion13. Generelt er pattedyr uegnede som dyremodeller til forståelse af neuroregenerering, da det lave antal neuroner, der produceres, ikke vil være tilstrækkeligt til at genoprette beskadigede neurale kredsløb observeret i PD. Som sådan er den teleostbaserede model, specifikt i zebrafisk, stærkt begunstiget for sin høje proliferative hastighed, evne til kontinuerligt at forny sig selv og lukke hjernehomologi med mennesker14,15.
Zebrafisk bruges oftest til at studere uordnet bevægelse i PD16. Den zebrafiskbaserede PD-model induceres normalt af neurotoksiner, som omfatter 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) og 6-hydroxydopamin (6-OHDA)17. Selvom de er effektive til at fremkalde specifikt tab af DpN og fald i dopaminniveauer, efterligner MPTP-baserede modeller ikke nøje betingelserne for PD, da DpN-tabet ikke kun er begrænset til CNS18. 6-OHDA’s manglende evne til at krydse blod-hjerne-barrieren begrænsede dens virkninger på cellulære og funktionelle ændringer i hjernen, når den administreres intrakranielt i modsætning til intramuskulært19. Perifer administration af 6-OHDA forårsagede en global reduktion af dopaminniveauet i hele nervesystemet20. Mens administration af 6-OHDA i cerebrospinalvæsken forårsagede ablation af DpN i hele CNS21, som ikke efterligner tilstanden som set i PD, hvorved tabet af DpN forekommer specifikt ved substantia nigra i den menneskelige hjerne. ICV-administration af 6-OHDA inducerede tværtimod specifikt signifikant ablation af DpN i området ventral Dn i zebrafiskens hjerne, som lignede substantia nigra22. Interessant nok blev genopretning af DpN rapporteret 30 dage efter 6-OHDA-induceret læsion, og disse neuroner overlevede i løbet af livet23,24. Den funktionelle genopretning af DpN blev demonstreret gennem en lokomotorisk vurdering af tilbagelagt afstand (cm) og gennemsnitshastighed (cm/s) ved hjælp af den 6-OHDA-inducerede voksne zebrafiskbaserede PD-model22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det foreliggende arbejde demonstrerede med succes den lokomotoriske vurdering af den etablerede 6-OHDA-inducerede, voksne zebrafiskbaserede PD-model. Hele eksperimentet involverede tre hovedtrin: præ-ICV mikroinjektionspræparater, ICV mikroinjektion af zebrafisk og lokomotorisk vurdering. For at sikre en sund genopretning af voksne zebrafisk efter ICV-mikroinjektionsproceduren og et godt eksperimentelt resultat er der i denne undersøgelse blevet anbefalet nogle gode fremgangsmåder for hvert trin.
<p class="jove_c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videregående Uddannelse Malaysia under Grundforskningstilskudsordningen [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
Materials
| Materials | |||
| 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
| Ascorbic acid | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
| Disposable pasteur pipette, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
| Microcentrifuge tube, 0.2 mL | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30124332 | |
| Nice conical flask, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA | – | version 7.0; video tracking software |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Göttingen, Germany | SE 2 | |
| FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000035 | |
| Femtotip II, sterile injection capillary | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242957000 | |
| InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000027 | |
| LED Portable Lamp | MR. DIY, Selangor, Malaysia | 9023251 | 20 mAh |
| PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
| Shanda aquarium heater | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
| Thermometer | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
| Video camera | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |
References
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson’s disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L. Estimation of the 2020 global population of Parkinson’s Disease (PD). Movement Disorder Council. 35 (1), 198 (2020).
- Hirsch, L., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T., Pringsheim, T. The Incidence of Parkinson’s Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology. 46 (4), 292-300 (2016).
- Przedborski, S. The two-century journey of Parkinson disease research. Nature Review Neuroscience. 18 (4), 251-259 (2017).
- Cookson, M. R. . Disease-Modifying Targets in Neurodegenerative Disorders. , 157-174 (2017).
- Jamebozorgi, K., et al. Cellular and molecular aspects of Parkinson treatment: Future therapeutic perspectives. Molecular Neurobiology. 56 (7), 1-13 (2018).
- Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Review Neuroscience. 21 (1), 1-13 (2020).
- Foltynie, T. Can Parkinson’s disease be cured by stimulating neurogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 978-980 (2015).
- Winner, B., Winkler, J. Adult neurogenesis in neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbour Perspect Biology. 7 (4), 021287 (2015).
- Huang, C., et al. Nerve guidance conduits from aligned nanofibers: improvement of nerve regeneration through longitudinal nanogrooves on a fiber surface. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (13), 7189-7196 (2015).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Dietz, V., Schwab, M. E. From the rodent spinal cord injury model to human application: promises and challenges. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1826-1830 (2017).
- La Rosa, C., Bonfanti, L. Brain plasticity in mammals: An example for the role of comparative medicine in the neurosciences. Frontiers in Veterinary Science. 5 (274), 1-8 (2018).
- Ferretti, P., Prasongchean, W. . Neural Stem Cells in Development, Adulthood and Disease. , 1-21 (2015).
- Vijayanathan, Y., et al. Adult endogenous dopaminergic neuroregeneration against Parkinson’s Disease: Ideal animal models. Neurotoxicity Research. 39 (2), 504-532 (2021).
- Vaz, R. L., Outeiro, T. F., Ferreira, J. J. Zebrafish as an animal model for drug discovery in Parkinson’s disease and other movement disorders: a systematic review. Frontier Neuroscience. 9, 347 (2018).
- Nie, S., et al. Small molecule TrkB agonist deoxygedunin protects nigrostriatal dopaminergic neurons from 6-OHDA and MPTP induced neurotoxicity in rodents. Neuropharmacology. 99, 448-458 (2015).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson’s disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson’s disease. Bioessays. 24 (4), 308-318 (2002).
- Anichtchik, O. V., Kaslin, J., Peitsaro, N., Scheinin, M., Panula, P. Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6-hydroxydopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Journal of Neurochemistry. 88 (2), 443-453 (2004).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. d. Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Vijayanathan, Y., et al. 6-OHDA-lesioned adult zebrafish as a useful Parkinson’s disease model for dopaminergic neuroregeneration. Neurotoxicity Research. 32 (3), 496-508 (2017).
- Caldwell, L. J., et al. Regeneration of dopaminergic neurons in adult zebrafish depends on immune system activation and differs for distinct populations. Journal of Neuroscience. 39 (24), 4694-4713 (2019).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. Journal of Comparative Neurology. 488 (3), 290-319 (2005).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture Research. 269 (1-4), 1-20 (2007).
- Reed, B., Jennings, M. Guidance on the Housing and Care of Zebrafish Danio rerio. Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA). , 7-53 (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Altenhofen, S., et al. Tebuconazole alters morphological, behavioral and neurochemical parameters in larvae and adult zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 180, 483-490 (2017).
- Bridi, D., Altenhofen, S., Gonzalez, J. B., Reolon, G. K., Bonan, C. D. Glyphosate and Roundup alter morphology and behavior in zebrafish. Toxicology. 392, 32-39 (2017).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nature Protocols. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Pienaar, I. S., Götz, J., Feany, M. B. Parkinson’s disease: insights from non-traditional model organisms. Progress in Neurobiology. 92 (4), 558-571 (2010).
- Becker, T., Becker, C. G. Axonal regeneration in zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 27, 186-191 (2014).
- Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
- Katz, E. M., et al. The stability and efficacy of tricaine methanesulfonate (MS222) solution after long-term storage. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (4), 393-400 (2020).
- Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
- Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, analgesia, anesthesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. 50 (4), 343-360 (2009).
- Barbosa Júnior, A., et al. . Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, 323-330 (2012).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e4434 (2013).
- Stewart, A., et al. Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology. 62 (1), 135-143 (2012).
- Sykes, D. J., Suriyampola, P. S., Martins, E. P. Recent experience impacts social behavior in a novel context by adult zebrafish (Danio rerio). PLOS ONE. 13 (10), 0204994 (2018).
- Collymore, C., Tolwani, R. J., Rasmussen, S. The behavioral effects of single housing and environmental enrichment on adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (3), 280-285 (2015).
- Grossman, L., et al. Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behavioural Brain Research. 214 (2), 277-284 (2010).
- Stewart, A., et al. Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behavioural Processes. 85 (2), 198-203 (2010).
- Abozaid, A., Tsang, B., Gerlai, R. The effects of small but abrupt change in temperature on the behavior of larval zebrafish. Physiology and Behavior. 227, 113169 (2020).
- Sekhar, M., Singh, R., Bhat, A., Jain, M. Feeding in murky waters: acclimatization and landmarks improve foraging efficiency of zebrafish (Danio rerio) in turbid waters. Biology Letters. 15 (7), 1-5 (2019).
- Valcarce, D. G., Martínez-Vázquez, J. M., Riesco, M. F., Robles, V. Probiotics reduce anxiety-related behavior in zebrafish. Heliyon. 6 (5), 03973 (2020).
- Tunbak, H., Vazquez-Prada, M., Ryan, T. M., Kampff, A. R., Dreosti, E. Whole-brain mapping of socially isolated zebrafish reveals that lonely fish are not loners. eLife. 9, 55863 (2020).
- Shams, S., Seguin, D., Facciol, A., Chatterjee, D., Gerlai, R. Effect of social isolation on anxiety-related behaviors, cortisol, and monoamines in adult zebrafish. Behavioral Neuroscience. 131 (6), 492-504 (2017).
- Burghardt, G. M., et al. Perspectives – Minimizing observer bias in behavioral studies: A review and recommendations. Ethology. 118 (6), 511-517 (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Franco-Restrepo, J. E., Forero, D. A., Vargas, R. A. A review of freely available, open-source software for the automated analysis of the behavior of adult zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 223-232 (2019).
- Beal, M. F. Parkinson’s disease: a model dilemma. Nature. 466 (7310), 8-10 (2010).
- Jha, U., Thirumalai, V. Neuromodulatory selection of motor neuron recruitment patterns in a visuomotor behavior increases speed. Current Biology. 30 (5), 788-801 (2020).
- Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Developmental Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
