Summary
Det föreliggande protokollet beskriver intracerebroventrikulär (ICV) injektion av vuxna zebrafiskar med neurotoxisk 6-hydroxigopamin (6-OHDA) vid ventral diencephalon (Dn) och bedömningen av försämringen och efterföljande återhämtning av simbeteendepostlesion genom att använda det öppna tanktestet, som åtföljs av analys med hjälp av en videospårningsprogramvara.
Abstract
Begränsningarna av nuvarande behandlingar för att fördröja dopaminerg neuronal förlust vid Parkinsons sjukdom (PD) ökar behovet av alternativa terapier som kan återställa dessa neuroner. Mycket ansträngning riktas för närvarande mot en bättre förståelse av neuroregeneration med hjälp av prekliniska in vivo-modeller . Denna regenerativa förmåga till självreparation är dock ineffektiv hos däggdjur. Icke-däggdjursdjur som zebrafisk har således framträtt som en utmärkt neuroregenerativ modell på grund av dess förmåga att kontinuerligt självförnya och ha en nära hjärnhomologi till människor. Som en del av ansträngningen att belysa cellulära händelser som är involverade i neuroregenerering in vivo har vi etablerat den 6-hydroxydopamin (6-OHDA) -inducerade vuxna zebrafiskbaserade PD-modellen. Detta uppnåddes genom den optimerade intracerebroventrikulära (ICV) mikroinjektionen av 99,96 mM 6-OHDA för att specifikt ablate dopaminerga neuroner (DpN) i ventral diencephalon (Dn) i zebrafiskhjärnan. Immunofluorescens indikerade mer än 85 % av DpN-ablationen vid dag tre efter förlossningen och fullständigt återställande av DpN vid lesionsstället 30 dagar efter förlossningen. Den föreliggande studien bestämde försämringen och efterföljande återhämtning av zebrafiskens simbeteende efter lesion genom att använda det öppna fälttestet genom vilket två parametrar, körd sträcka (cm) och medelhastighet (cm / s), kvantifierades. Förflyttningen bedömdes genom att analysera inspelningarna av enskilda fiskar i varje grupp (n = 6) med hjälp av videospårningsprogramvara. Resultaten visade en signifikant (p < 0,0001) minskning av hastighet (cm / s) och körd sträcka (cm) för lesionerad zebrafisk 3 dagar efter 3 dagar efter sham. Den lesionerade zebrafisken uppvisade full återhämtning av simbeteende 30 dagar efter böjningen. De nuvarande resultaten tyder på att 6-OHDA-lesionerad vuxen zebrafisk är en utmärkt modell med reproducerbar kvalitet för att underlätta studien av neuroregeneration i PD. Framtida studier om mekanismerna bakom neuroregenerering samt inneboende och yttre faktorer som modulerar processen kan ge viktig inblick i nya strategier för cellersättningsbehandling mot PD.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD), en sjukdom som tydligt kännetecknas av muskelstyvhet, vilande tremor och bradykinesi, är den snabbast växande neurologiska sjukdomen i världen1,2. Risken och förekomsten av PD ökar snabbt med åldern, särskilt hos individer i åldern 50 år och äldre3. Etiologin och patogenesen av PD hittills är fortfarande dåligt förstådd. Detta har ofta lämnat den tidiga starten av PD odiagnostiserad. För närvarande är bristen på dopamin och förlusten av dopaminerga nervceller (DpN) hos PD-patienter starkt kopplade till manifestationen av motoriska symtom4. Genom att dra nytta av detta förhållande har flera behandlingar utformats antingen för att fungera direkt som dopaminersättning (dvs. levodopa) eller för att kompensera för förlusten av DpN (dvs. djup hjärnstimulering). Även om dessa behandlingar medför symtomatiska fördelar, ändrar de inte sjukdomsförloppets försämrade förlopp5. Mot bakgrund av denna betydande svaghet har cellersättningsterapi föreslagits. Effekten av detta tillvägagångssätt är emellertid inkonsekvent med tanke på utmaningarna med transplantatberedning, celltillväxtkontroll och fenotypinstabilitet. Cellersättningsterapi, som hade väckt etiska problem, utgör också risken för att inducera hjärntumörer och oönskade immunreaktioner6,7.
Begränsningarna i nuvarande terapeutiska strategier har lett till en större tonvikt på regenerering av DpN som ett potentiellt tillvägagångssätt vid behandling av PD. Regenerering av DpN eller neuroregeneration har framstått som ett av de lovande genombrotten i hanteringen av PD, inte bara på grund av dess potential som en ny terapeutisk metod utan också som medel för att förstå sjukdomsmekanismen8, 9. Detta tillvägagångssätt fokuserar på återställande av neuronal funktion genom differentiering, migration och integration av befintliga stamceller i de lesionerade kretsarna10. För att ytterligare utforska neuroregeneration har olika in vivo-studier genomförts. Det visade sig att ryggradsdjur som däggdjur, amfibier och reptiler genererar nya hjärnceller efter skada11,12. Bland ryggradsdjuren är däggdjursdjur mer eftertraktade med tanke på deras genetiska likhet med människor. Däggdjur uppvisar dock begränsad och dålig reparativ kapacitet i centrala nervsystemet (CNS) som kan pågå genom vuxen ålder efter en hjärnskada13. I allmänhet är däggdjur olämpliga som djurmodeller för att förstå neuroregenerering med tanke på att det låga antalet neuroner som produceras inte kommer att vara tillräckligt för att återställa skadade neurala kretsar som observerats vid PD. Som sådan är den teleostbaserade modellen, särskilt i zebrafisk, mycket gynnad för sin höga proliferativa hastighet, förmåga att kontinuerligt självförnya och stänga hjärnhomologi med människor14,15.
Zebrafisk används oftast för att studera oordnad rörelse i PD16. Den zebrafiskbaserade PD-modellen induceras vanligtvis av neurotoxiner, som inkluderar 1-metyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) och 6-hydroxydopamin (6-OHDA)17. Även om det är effektivt för att inducera specifik förlust av DpN och minskning av dopaminnivåer, efterliknar MPTP-baserade modeller inte nära villkoren för PD eftersom DpN-förlusten inte är begränsad enbart till CNS18. Oförmågan hos 6-OHDA att passera blod-hjärnbarriären begränsade dess effekter på cellulära och funktionella förändringar i hjärnan när det administreras intrakraniellt i motsats till intramuskulärt19. Perifer administrering av 6-OHDA orsakade en global minskning av dopaminnivåerna i hela nervsystemet20. Medan administrering av 6-OHDA i cerebrospinalvätskan orsakade ablation av DpN i hela CNS21, vilket inte efterliknar tillståndet som ses i PD varigenom förlusten av DpN uppträder specifikt vid substantia nigra i den mänskliga hjärnan. ICV-administrering av 6-OHDA, tvärtom, inducerade specifikt signifikant ablation av DpN i området ventral Dn i zebrafiskhjärnan, som liknade substantia nigra22. Intressant nog rapporterades återhämtning av DpN 30 dagar efter 6-OHDA-inducerad lesion och dessa neuroner överlevde under livet23,24. Den funktionella återhämtningen av DpN demonstrerades genom en lokomotorisk bedömning av tillryggalagd sträcka (cm) och medelhastighet (cm/s) med användning av den 6-OHDA-inducerade vuxna zebrafiskbaserade PD-modellen22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den föreliggande studien har godkänts av kommittén för djurforskning och etik (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Referensnr: UiTM CARE 346/2021, daterad den 7 maj 2021].
OBS: De publicerade protokollen22,25,26 för standardhållning och underhåll av den 6-OHDA-lesionerade vuxna zebrafisken PD-modellen användes. Experiment utfördes med vuxna manliga zebrafiskar (Danio rerio) i åldern mer än fem månader gamla med en standardiserad längd på 3,2-3,7 cm.
1. Zebrafiskunderhåll och pre-ICV-mikroinjektionspreparat
- Håll fisken i en luftad vattentank under en kontrollerad temperatur på 28 ± 1,0 °C. För zebrafiskhållning och underhåll, använd destillerat vatten mineraliserat med kommersiellt havssalt (1 g / L) under hela experimentet27.
- Hus högst 25 fiskar per 45 L tank eller en fisk per 1,8 L vatten och utsätt dem för ett schema med 14 h ljus och 10 h mörk fotoperiod. Foder fisken minst två gånger per dag med matpellets kompletterad med frystorkade maskar.
- Bered en koncentrerad stamlösning av trikainmetansulfonat (MS-222) genom upplösning av 2,5 g MS-222 och 5 g natriumbikarbonat i 250 ml destillerat vatten. Späd 2 ml stamlösning för att producera 200 ml arbetsanestesilösning.
- Förbered 99,96 mM 6-OHDA genom att först lösa upp 0,2 mg askorbinsyra i 1 ml av 0,9 % med sterilfiltrerad NaCl. Filtrera lösningen med 0,2 mikron filter innan du tillsätter 25 mg 6-OHDA i pulverform i lösningen. Förbered lösningen färsk före varje injektion och förvara den i mörker vid 4 °C.
VARNING: Använd lämplig personlig skyddsutrustning (dvs. handskar, laboratorierock och ansiktsmask) och öva god laboratoriepraxis vid hantering av kemikalierna. All hantering av kemikalierna ska ske i ett biosäkerhetsskåp.
2. Anestesi och ICV-injektion av zebrafisk
- Snabba fisken i 24 timmar för att undvika uppstötningar under anestesi. Bedöva fisken genom att nedsänka den i en behållare som innehåller 0,01 % viktprocent MS-222-lösning i cirka 1 minut eller tills all synlig muskelrörelse upphör.
- Placera den bedövade fisken på en vattendränkt svamp placerad under ett stereomikroskop och blöt fisken regelbundet.
- Identifiera positionen för injektion baserat på skärningspunkten mellan den metopiska suturen (MS), koronal sutur (CS) och sagittal sutur (SS) som förbinder zebrafiskhjärnans frontala och parietala skalle.
- Gör ett litet hål på 1,0 mm2 yta med en skarp 27 G nål i skallen som styrs av den specifika anatomiska positionen på zebrafiskskallen (figur 1A,B).
- Sänk mikrokapillärinjektorn i 60 ° vinkel tills den når ett djup av 1 200 μm från zebrafiskskallens kranialtak (Figur 1C). Tryck på Z-gränsen för att fixa positionen.
- Ställ in det initiala injektionstrycket på 4000 hPa och kompensationstrycket till 10 hPa. Ställ in injektionstiden till 0,3 s. Sänk injektionsintensiteten med varje efterföljande injektion.
- Injicera 0,5 μL av 99,96 mM neurotoxin 6-OHDA (eller 0,9% w / v saltlösning för bluffkontrollgrupp) och låt mikrokapillären vila i 20 s. Fortsätt att blöta fisken med destillerat vatten under hela injektionsprocessen för att förhindra uttorkning.
- Ta långsamt bort mikrokapillären och återuppliva fisken under rinnande destillerat vatten. Placera fisken i en isolerad återvinningstank och ta bort eventuella distraktioner som potentiellt kan störa återhämtningsprocessen.
- Spola mikrokapillären före nästa injektion för att rensa blockeringen och se till att injektionsintensiteten är tillräcklig för att ge den önskade volymen på 0,5 μL 6-OHDA.
Figur 1: Injektionsstället för neurotoxin, 6-OHDA. (A) Punkten för mikrokapillär inträde styrs av skärningspunkten mellan den metopiska suturen (MS), koronalsuturen (CS) och sagittal sutur (SS) som förbinder zebrafiskhjärnans främre och parietala skalle (planvy). (B) En schematisk ritning (planvy) av zebrafiskens skalle och hjärna visar mikrokapillären, som sänks direkt ovanför habenula (Hab), och dess ingångspunkt vid skärningspunkten mellan halvklotet. (C) En schematisk ritning (sagittal sektion) av zebrafiskhjärnan visar injektionsvinkeln och penetrationsdjupet. Den svarta pricken representerar den lesionerade platsen som ligger ovanför det riktade området, den ventrala diencephalonen. Förkortningar: 6-OHDA: 6-hydroxydopamin, CS: koronal sutur, Dn: diencephalon, Hab: habenula, Hyp: hypotalamus, MS: metopisk sutur, OB: olfaktorisk glödlampa, POA: preoptiskt område, PT: bakre tuberkulum, SS: sagittal sutur, Tec: tectum och Tel: telencefalon. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Lokomotorisk bedömning
OBS: Lokomotorisk bedömning av zebrafisk (n = sex / grupp; sham vs lesion) bedömdes individuellt via det öppna tanktestet med hjälp av etablerade protokoll28,29 vid dag tre och dag 30 efter 6-OHDA-lesion.
- Videoinspelning
- Placera experimenttanken (längd 20 cm, bredd 11,5 cm, höjd 13 cm) med väggarna täckta med vitt papper på en upphöjd plattform (figur 2A).
- Belysa tanken från botten med en ljuskälla. Fyll tanken med destillerat vatten (80% -90% fullt) och håll temperaturen vid 28 ± 1,0 ° C. Mät temperaturen med en termometer och reglera den med en kommersiell akvarievärmare.
- Efter minst 2 minuters acklimatisering, registrera fiskens simningsbeteende från en planvy på experimentarenans 2-dimensionella (2D) plan med hjälp av en videokamera i 5 minuter (Figur 2B). För att undvika inkonsekvens i simningsbeteendet för den tidigare och den sista satsen inspelningar, överskrid inte acklimatiseringen med 10 min30.
- Analysera videorna med hjälp av videospårningsprogramvara med open-tank-protokollet för förvärv av tillryggalagd sträcka (cm) och medelhastighet (cm / s) för varje ämne.
Figur 2: Experimentell inställning av ett öppet tanktest för bedömning av zebrafiskens rörelsebeteende. (A) Experimenttanken (framifrån) placeras på en upphöjd plattform som är upplyst underifrån. Tankens fyra väggar är täckta med vitt papper och inspelningarna fångas axiellt. Temperaturen mäts med hjälp av en termometer och regleras vid 28 ± 1,0 ° C med hjälp av en kommersiell akvarievärmare. (B) Skärmdump (planvy) av videoinspelning som spelas in med hjälp av inställningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Dataanalys
- Dubbelklicka på ikonen för att öppna programvaran för videospårning. Klicka på fliken Arkiv och välj Skapa nytt tomt experiment. Detta gör det möjligt för användaren att anpassa experimentparametrarna enligt undersökningens mål.
- Klicka på fliken Protokoll , välj Videokällor och klicka på Lägg till ny videokälla. Klicka på den tillgängliga listrutan och välj Videofil alternativ. Detta kommer att uppmana popup-fönstret för filbläddring från vilket videoinspelningar av intresse kan väljas.
- Klicka på underfliken Apparat och välj ikonen Rektangulär för att ställa in apparaten. Dra den rektangulära ikonen för att täcka hela experimentarenan. Ställ in skalstången i enlighet med detta och mata in det numeriska värdet för skalmätningen som används i linjalsektionens längd. Det aktuella experimentet använde en skala på 10 mm för det öppna tanktestet.
- Ställ in djurfärgen genom att välja Djuren är mörkare än Apparatens bakgrund. Lämna de andra tillgängliga alternativen i Spårning till de förinställda standardinställningarna.
- Klicka på den tidigare ritade apparaten på underfliken Zoner . Denna zon är inställd som standardzon där positionen är densamma för alla tester.
- Välj följande alternativ under testschemaläggning och testdatarapport: Testvaraktighet, Total körd sträcka och Medelhastighet. Andra tillgängliga tester på listan är valfria och beroende av forskarens utredningsintresse.
- På fliken Försök tilldelar du djuren enligt deras testgrupp genom att skriva in gruppnamnet under avsnittet Namn och antalet djur per grupp i avsnittet Antal djur .
- Växla till fliken Tester för att köra experimentet. Klicka på Starta test ikonen och vänta tills alla videor analyseras.
- På fliken Resultat klickar du på ikonen Visa rapporten för att visa rörelsedata i textrapportform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det föreliggande experimentet bedömde förändringarna i vuxna zebrafiskars simbeteende efter ICV-mikroinjektion med 6-OHDA. Anledningen till att använda 6-OHDA som det valda neurotoxinet berodde på dess oförmåga att korsa blod-hjärnbarriären, vilket gav specifik och riktad ablation av DpN inom området intresse-ventral diencephalon (Dn)16. DpN-delpopulationen har här anatomisk likhet med DpN-delpopulationen i människans substantia nigra pars compacta31.
Enligt vårt tidigare arbete22 bekräftades den cellulära effekten av 6-OHDA ICV-mikroinjektion mot DpN hos vuxna zebrafiskar genom immunhistostainering av DpN-markörtyrosinhydroxylas (TH). Den huvudsakliga hjärnregionen av intresse var Dn, som består av det preoptiska området (POA), bakre tuberkulum (PT) och hypotalamus (Hyp). Det visade sig att 99,96 mM 6-OHDA resulterade i en 100% överlevnad av den vuxna zebrafisken med det lägsta antalet TH-immunoreaktiva (TH-ir) i Dn. Det visade sig också att mer än 85% (p < 0,01) av TH-ir DpN i Dn var ablated på dag tre postlesion. Antalet TH-ir DpN ökade sedan med mer än 50% vid postlesion dag 14 innan full regenerering uppnåddes 30 dagar efter flyttning (figur 3). Dessa data stöder de regenerativa egenskaperna hos DpN-subpopulationen i Dn hos vuxna zebrafiskar efter ablation32.
Figur 3: Regenerering av DpN i Dn-regionen av zebrafisk lesionerad med 99,96 mM 6-OHDA. (A) Antalet TH-ir DpN i tre huvudområden i Dn-regionen, POA, PT och Hyp, över fyra datapunkter: sham, 3, 14 och 30 dagar efter lesion med 99,96 mM 6-OHDA neurotoxin. Varje stapel representerar medelvärdet ± SD av n = 6 oberoende experiment; *p < 0,05. B) Representativa konfokalmikroskopbilder av sagittalt sektionerad zebrafiskhjärna av sham (I, I', and I''), 3 dagar efter lesion (II, II', och II''), 14 dagar efter lesion (III, III', och III'') och 30 dagar efter lesionering (IV, IV', och IV'') färgade med TH (DpN; grön) och DAPI (kärnor; blå). Skalstång = 50 μm. Förkortningar- DAPI: 4′, 6-diamidino-2-fenylindol, 6-OHDA: 6-hydroxidopamin, Dn: diencefalon, DpN: dopaminerga neuroner, Hyp: hypotalamus, POA: preoptiskt område, PT: bakre tuberkulum, SD: standardavvikelse och TH-ir: tyrosinhydroxylas immunoreaktiv. Anpassad från Vijayanathan et al.22. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Vi utförde sedan lokomotorisk bedömning med hjälp av det öppna tanktestet för att undersöka förändringar i körd sträcka (cm) och medelhastighet (cm / s) för vuxna zebrafiskar efter ICV-mikroinjektion av 6-OHDA och sham. Experimentell fisk bedömdes sedan på dag tre postlesion (minst antal TH-ir DpN observerade) och dag 30 postlesion (helt återställd DpN rapporterad vid lesionsstället). Analys av zebrafiskens simbeteende med hjälp av en videospårningsprogramvara indikerade att både medelhastigheten (cm / s) och avståndet (cm) för den lesionerade gruppen på dag tre efter förlossningen minskade signifikant (p < 0.001) till <45% jämfört med sham (figur 4). Den lesionerade gruppen uppvisade återhämtning av motorisk funktion 30 dagar efter förlossningen utan någon signifikant skillnad mellan både medelhastighet (cm / s) och körd sträcka (cm) jämfört med sham.
Figur 4: Förändringar i simbeteende efter intracerebroventrikulär injektion med 6-OHDA. Simningsbeteende hos vuxna zebrafiskar bedömdes före lesion, på dag tre och dag 30 postlesion med 99,96 mM 6-OHDA. Parametrar som bedömdes inkluderade: (A) medelhastighet (cm/s) och (B) tillryggalagd sträcka (cm). Varje stapel representerar medelvärdet ± SD på sex fiskar; p < 0,0001 (Student t-test). Förkortningar: 6-OHDA: 6-hydroxydopamin, SD: standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det aktuella arbetet visade framgångsrikt den lokomotoriska bedömningen av den etablerade 6-OHDA-inducerade, vuxna zebrafiskbaserade PD-modellen. Hela experimentet involverade tre huvudsteg: pre-ICV mikroinjektionspreparat, ICV-mikroinjektion av zebrafisk och lokomotorisk bedömning. För att säkerställa en hälsosam återhämtning av vuxna zebrafiskar efter ICV-mikroinjektionsförfarandet och goda experimentella resultat har vissa goda metoder för varje steg rekommenderats i den aktuella studien.
Pre-ICV mikroinjektionsberedning: Djurval utfördes bäst dagen före experimentet. Könet identifierades och fiskens längd mättes. Manlig vuxen zebrafisk med en standardiserad längd på 3,2-3,7 cm placerades i en separat experimentell tank. Dessutom bör fisken genomgå en fasteperiod på 24 timmar för att undvika uppstötningar under anestesi33. En fisktank (med sina fyra väggar täckta med vitt papper) med en stående vattentank inrättad bör förberedas före experimentet för att minska den yttre stressen och hjälpa zebrafiskens återhämtningsprocess. Alla kemikalier bereddes färska innan varje experiment inleddes eftersom de kunde försämras snabbt med tiden och bli instabila vid rumstemperatur34,35.
Mikroinjektion av 6-OHDA:Ren och skonsam hantering av zebrafisk bör utföras under hela processen för att förhindra införande av onödig skada och infektion på fisken. Fisken ska placeras ovanpå en våt svamp och hållas i fuktigt skick för att undvika uttorkning36. Ett litet snitt gjordes med hjälp av en steril nål med fast och lämplig kraft för att undvika extra tryck som kan spricka zebrafiskens skalle. Detta snitt bör tillåta inträde av mikrokapillären i hjärnhålan. Mikrokapillären sänktes sedan till ett djup av 1 200 μm från ingångspunkten, som ligger mellan två halvklot - telencephalon och tectum (figur 1B, C). Ingångspunkten valdes mellan dessa halvklot för att förhindra ytterligare laceration av neuroner37. Denna teknik involverade användning av en mikroinjektor, trycket och tidpunkten för leveransen bör kalibreras för att säkerställa leverans av 0,5 μL neurotoxin. Denna kalibrering kan utföras genom att mäta storleken på droppen som bildas på filterpapperet38. Vår praxis involverade vanligtvis följande uppsättning programmerbara parametrar varigenom injektionsintensiteten sänktes med varje efterföljande injektion (injektionstryck: 4000 hPa, injektionstid: 0,3 s och kompensationstryck: 10 hPa). För att undvika att neurotoxinet läcker ut ur hjärnhålan applicerades ett intervall på 20 s mellan injektion och uttag av mikrokapillären35. På grund av kapillärens lilla storlek kan mikrokapillären blockeras efter varje injektion. Som sådan bör mikrokapillären i huvudsak spolas före nästa injektion för att rensa blockeringen och säkerställa att injektionsintensiteten är tillräcklig för att ge den önskade volymen 0,5 μL 6-OHDA. Fisken skulle sedan överföras till en återvinningstank som hålls vid 28 ± 1,0 °C. Om fisken inte återhämtar sig inom 30 s, spola ut sin gäl och mun med destillerat vatten tills full återhämtning av muskelrörelser sker.
Lokomotorisk bedömning: För att säkerställa god lokomotorisk bedömning på 6-OHDA-inducerad vuxen zebrafisk bör beteendestudien genomföras inom samma tidsram för varje tidpunkt. Varje beteendestudie bör möjliggöra en minst 2 minuters acklimatiseringsperiod och bör utföras inom 4 h39. Det aktuella experimentet utfördes tidigt på morgonen mellan 08.00 och 12.00 eftersom zebrafiskar var mer aktiva under denna period40. En längre acklimatiseringsperiod är nödvändig om zebrafiskar uppvisar något onormalt beteende med tydliga tecken på stress och ångest (frysning och oberäkneligt beteende)41. För att undvika inkonsekvens i simningsbeteendet hos den tidigare och den sista satsen inspelningar bör acklimatiseringen dock inte överstiga 10 min30. För det öppna fälttestet kan en experimentell tank av valfri storlek, färg, form och textur användas för inspelningar som sträcker sig från minst 5 till 30 min42,43. Zebrafiskens beteende påverkas starkt av omgivningens temperatur. Små fluktuationer på mer än 4 °C kan i hög grad påverka simhastigheten44. Därför bör temperaturen på vattnet i experimenttanken strikt bibehållas under en kontrollerad temperatur på 28 ± 1,0 ° C med hjälp av en kommersiell värmare, och vattennivån hölls cirka 12 cm djup under hela experimentet. Tankens väggar täcktes med vitt papper för att skapa kontrast mellan testpersonen och experimentarenan samt för att minska yttre stimuli som kan orsaka en oförutsedd reaktion från testpersoner45. Fisken från varje grupp testades individuellt i enlighet med gällande standardpraxis för zebrafisk neurobeteendeforskning23,37,46. Med tanke på zebrafiskarnas benägenhet för sociala interaktioner finns det en oro för att isolering under testperioden kan påverka deras beteende47. Den nuvarande experimentella inställningen var dock begränsad till högst 10 minuter per försök och denna korta isoleringsperiod visade sig inte ha någon effekt på den rörelsemotoriska aktiviteten hos vuxna zebrafiskar48. För att ge korrekt datainsamling för beteendestudien utfördes bedömningen genom att slumpmässigt välja zebrafisken från olika experimentella grupper (dvs. alternera två zebrafiskar från antingen sham- och 6-OHDA-lesionsgruppen tills n = 6) under det öppna tanktestet49. De inspelade videorna analyserades med hjälp av ett videospårningssystem som vanligtvis används för gnagares beteendespårning. Eftersom zebrafisk är en framväxande djurmodell är beteendetesterna som utförs med zebrafisk vanligtvis anpassade från den etablerade vetenskapliga litteraturen om gnagare50. Här demonstrerade vi videospårningsprogramvarans förmåga att automatiskt spåra zebrafisk på den experimentella arenan och effektivt beräkna önskade parametrar. Programvaran för videospårning skilde sig från den andra tillgängliga programvaran på grund av de olika videofiler som stöds av programvaran, regelbundna uppdateringar av paket och stöd för olika operativsystem51.
En av begränsningarna hos befintliga djurbaserade PD-modeller är bristen på mekanistiska likheter som efterliknar den motoriska försämringen som observerats efter dopaminerg neuronal förlust i substantia nigra pars compacta i den mänskliga hjärnan52. Framväxten av den vuxna zebrafiskbaserade PD-modellen kan dock ta itu med just denna begränsning. Som observerats i föreliggande studie motsvarade den minskade simhastigheten våra tidigare cellulära fynd, varigenom mer än 85% dopaminerg neuronal förlust i ventral diencefalon av 6-OHDA-inducerad vuxen zebrafisk modell tre dagar efter läsion22. Det verkar som om specifik ablation av dopaminerga nervceller inom detta intresseområde krävs för att störa den nedåtgående motoriska signaleringen från hjärnan, vilket orsakar långsamhet i rörelsen53. L. J. Caldwell, et al.23 som utförde ICV-injektion av 6-OHDA vid det optiska tectum (ingångspunkten), observerade till exempel endast förändringar i zebrafiskens stimning och parningsbeteende. Ablation av DpN i ventral Dn är avgörande eftersom populationen av DpN i Dn av vuxna zebrafiskar fungerar som den enda dopaminkällan för zebrafiskmotorneuroner. Detta är analogt med den mänskliga substantia nigra54. Den föreliggande studien observerade också snabbare simhastighet och längre sträcka som reste av lesionerade zebrafiskar i senare tidpunkter efter flyttning, vilket indikerar fortsatt och i slutändan fullständig återställning av dopaminsignalering som styr zebrafiskens simbeteende. Dessa fynd validerade således förmågan hos nyligen regenererade dopaminerga neuroner att återfå sina funktionella aktiviteter hos lesionerade vuxna zebrafiskar.
Den nuvarande appliceringsvägen för 6-OHDA involverade ett något invasivt injektionsparadigm som krävde införande av mikrokapillär djupt in i hjärnan, mot lesionsområdet för ventral Dn. Denna metod är något mödosam i jämförelse med perifer injektion och måste utföras inom 3 minuter per fisk för att minska risken för dödlighet efter injektion. Som sådan krävs tidigare övning av ICV-injektion för att säkerställa att metoden kan utföras inom den kritiska varaktigheten vid målområdet (Dn). För att uppnå en giltig lokomotorisk bedömning av vuxna zebrafiskar är testet med öppen tank begränsat till endast 4 timmars bedömningsperiod per dag. Därför krävs förhandsplanering i en experimentell ram som involverar ett stort antal djur, varigenom extra tid bör avsättas för att säkerställa att installationen uppfyllde minimikraven för varje inspelning (t.ex. temperatur och vattendjup). Denna planering är särskilt avgörande i tidsbaserade experiment som den aktuella studien, eftersom varje inspelning måste utföras på den avsedda tidpunkten. Den nuvarande experimentella inställningen var begränsad till studien av två simningsparametrar som specifikt bedömde zebrafiskens motorfunktion. Andra beteendeparametrar som shoaling och ångestliknande beteende krävde dock andra experimentella inställningar och olika analysmetoder. Sammanfattningsvis är detta en reproducerbar och användbar metod för att studera DpN-neuroregenerationsprocessen i 6-OHDA-inducerad vuxen zebrafisk som kan ge viktiga insikter i strategier för cellersättningsbehandling mot PD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ministeriet för högre utbildning Malaysia inom ramen för systemet för bidrag till grundforskning [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
| Ascorbic acid | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
| Disposable pasteur pipette, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
| Microcentrifuge tube, 0.2 mL | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30124332 | |
| Nice conical flask, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA | - | version 7.0; video tracking software |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Göttingen, Germany | SE 2 | |
| FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000035 | |
| Femtotip II, sterile injection capillary | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242957000 | |
| InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000027 | |
| LED Portable Lamp | MR. DIY, Selangor, Malaysia | 9023251 | 20 mAh |
| PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
| Shanda aquarium heater | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
| Thermometer | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
| Video camera | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |
References
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L. Estimation of the 2020 global population of Parkinson's Disease (PD). Movement Disorder Council. 35 (1), 198 (2020).
- Hirsch, L., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T., Pringsheim, T. The Incidence of Parkinson's Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology. 46 (4), 292-300 (2016).
- Przedborski, S. The two-century journey of Parkinson disease research. Nature Review Neuroscience. 18 (4), 251-259 (2017).
- Cookson, M. R. Disease-Modifying Targets in Neurodegenerative Disorders. , Academic Press. Ch. 6 157-174 (2017).
- Jamebozorgi, K., et al. Cellular and molecular aspects of Parkinson treatment: Future therapeutic perspectives. Molecular Neurobiology. 56 (7), 1-13 (2018).
- Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Review Neuroscience. 21 (1), 1-13 (2020).
- Foltynie, T. Can Parkinson's disease be cured by stimulating neurogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 978-980 (2015).
- Winner, B., Winkler, J.
- Huang, C., et al. Nerve guidance conduits from aligned nanofibers: improvement of nerve regeneration through longitudinal nanogrooves on a fiber surface. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (13), 7189-7196 (2015).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Dietz, V., Schwab, M. E. From the rodent spinal cord injury model to human application: promises and challenges. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1826-1830 (2017).
- La Rosa, C., Bonfanti, L. Brain plasticity in mammals: An example for the role of comparative medicine in the neurosciences. Frontiers in Veterinary Science. 5 (274), 1-8 (2018).
- Ferretti, P., Prasongchean, W. Neural Stem Cells in Development, Adulthood and Disease. , Springer. 1-21 (2015).
- Vijayanathan, Y., et al. Adult endogenous dopaminergic neuroregeneration against Parkinson's Disease: Ideal animal models. Neurotoxicity Research. 39 (2), 504-532 (2021).
- Vaz, R. L., Outeiro, T. F., Ferreira, J. J. Zebrafish as an animal model for drug discovery in Parkinson's disease and other movement disorders: a systematic review. Frontier Neuroscience. 9, 347 (2018).
- Nie, S., et al. Small molecule TrkB agonist deoxygedunin protects nigrostriatal dopaminergic neurons from 6-OHDA and MPTP induced neurotoxicity in rodents. Neuropharmacology. 99, 448-458 (2015).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T.
- Anichtchik, O. V., Kaslin, J., Peitsaro, N., Scheinin, M., Panula, P. Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6-hydroxydopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Journal of Neurochemistry. 88 (2), 443-453 (2004).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. d Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Vijayanathan, Y., et al. 6-OHDA-lesioned adult zebrafish as a useful Parkinson's disease model for dopaminergic neuroregeneration. Neurotoxicity Research. 32 (3), 496-508 (2017).
- Caldwell, L. J., et al. Regeneration of dopaminergic neurons in adult zebrafish depends on immune system activation and differs for distinct populations. Journal of Neuroscience. 39 (24), 4694-4713 (2019).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. Journal of Comparative Neurology. 488 (3), 290-319 (2005).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture Research. 269 (1-4), 1-20 (2007).
- Reed, B., Jennings, M. Guidance on the Housing and Care of Zebrafish Danio rerio. Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA). , 7-53 (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Altenhofen, S., et al. Tebuconazole alters morphological, behavioral and neurochemical parameters in larvae and adult zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 180, 483-490 (2017).
- Bridi, D., Altenhofen, S., Gonzalez, J. B., Reolon, G. K., Bonan, C. D. Glyphosate and Roundup alter morphology and behavior in zebrafish. Toxicology. 392, 32-39 (2017).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nature Protocols. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Pienaar, I. S., Götz, J., Feany, M. B. Parkinson's disease: insights from non-traditional model organisms. Progress in Neurobiology. 92 (4), 558-571 (2010).
- Becker, T., Becker, C. G.
- Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
- Katz, E. M., et al. The stability and efficacy of tricaine methanesulfonate (MS222) solution after long-term storage. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (4), 393-400 (2020).
- Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
- Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, analgesia, anesthesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. 50 (4), 343-360 (2009).
- Barbosa Júnior, A., et al. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Springer. 323-330 (2012).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F.
- Stewart, A., et al. Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology. 62 (1), 135-143 (2012).
- Sykes, D. J., Suriyampola, P. S., Martins, E. P. Recent experience impacts social behavior in a novel context by adult zebrafish (Danio rerio). PLOS ONE. 13 (10), 0204994 (2018).
- Collymore, C., Tolwani, R. J., Rasmussen, S. The behavioral effects of single housing and environmental enrichment on adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (3), 280-285 (2015).
- Grossman, L., et al. Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behavioural Brain Research. 214 (2), 277-284 (2010).
- Stewart, A., et al. Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behavioural Processes. 85 (2), 198-203 (2010).
- Abozaid, A., Tsang, B., Gerlai, R. The effects of small but abrupt change in temperature on the behavior of larval zebrafish. Physiology and Behavior. 227, 113169 (2020).
- Sekhar, M., Singh, R., Bhat, A., Jain, M. Feeding in murky waters: acclimatization and landmarks improve foraging efficiency of zebrafish (Danio rerio) in turbid waters. Biology Letters. 15 (7), 1-5 (2019).
- Valcarce, D. G., Martínez-Vázquez, J. M., Riesco, M. F., Robles, V. Probiotics reduce anxiety-related behavior in zebrafish. Heliyon. 6 (5), 03973 (2020).
- Tunbak, H., Vazquez-Prada, M., Ryan, T. M., Kampff, A. R., Dreosti, E. Whole-brain mapping of socially isolated zebrafish reveals that lonely fish are not loners. eLife. 9, 55863 (2020).
- Shams, S., Seguin, D., Facciol, A., Chatterjee, D., Gerlai, R. Effect of social isolation on anxiety-related behaviors, cortisol, and monoamines in adult zebrafish. Behavioral Neuroscience. 131 (6), 492-504 (2017).
- Burghardt, G. M., et al. Perspectives - Minimizing observer bias in behavioral studies: A review and recommendations. Ethology. 118 (6), 511-517 (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Franco-Restrepo, J. E., Forero, D. A., Vargas, R. A. A review of freely available, open-source software for the automated analysis of the behavior of adult zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 223-232 (2019).
- Beal, M. F. Parkinson's disease: a model dilemma. Nature. 466 (7310), 8-10 (2010).
- Jha, U., Thirumalai, V. Neuromodulatory selection of motor neuron recruitment patterns in a visuomotor behavior increases speed. Current Biology. 30 (5), 788-801 (2020).
- Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Developmental Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
