Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Lokomotorisk vurdering af 6-hydroxydopamin-induceret voksen zebrafisk-baseret Parkinsons sygdomsmodel

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63355
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1, 2, 1
1Collaborative Drug Discovery Research (CDDR) Group and Brain Degeneration and Therapeutics Group, Faculty of Pharmacy, Universiti Teknologi MARA (UiTM), Cawangan Selangor, Kampus Puncak Alam, 2Department of Medicine, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

Denne protokol beskriver intracerebroventrikulær (ICV) injektion af voksne zebrafisk med neurotoksisk 6-hydroxydopamin (6-OHDA) ved den ventrale diencephalon (Dn) og vurderingen af svækkelsen og efterfølgende genopretning af svømmeadfærd postlesion ved hjælp af åben tank test, som ledsages af analyse ved hjælp af en video tracking software.

Abstract

Begrænsningerne i de nuværende behandlinger i forsinkelse af dopaminerg neuronalt tab i Parkinsons sygdom (PD) øger behovet for alternative terapier, der kan genoprette disse neuroner. En stor indsats er i øjeblikket rettet mod en bedre forståelse af neuroregenerering ved hjælp af prækliniske in vivo-modeller . Denne regenerative evne til selvreparation er imidlertid ineffektiv hos pattedyr. Ikke-pattedyrsdyr som zebrafisk har således vist sig som en fremragende neuroregenerativ model på grund af dens evne til kontinuerligt at forny sig selv og have en tæt hjernehomologi til mennesker. Som en del af indsatsen for at belyse cellulære hændelser involveret i neuroregenerering in vivo har vi etableret den 6-hydroxydopamin (6-OHDA)-inducerede voksne zebrafisk-baserede PD-model. Dette blev opnået gennem den optimerede intracerebroventrikulære (ICV) mikroinjektion af 99,96 mM 6-OHDA til specifikt at ablate dopaminerge neuroner (DpN) i den ventrale diencephalon (Dn) af zebrafisk hjerne. Immunofluorescens indikerede mere end 85% af DpN-ablationen på dag tre efter og fuld restaurering af DpN på læsionsstedet 30 dage efter udslip. Den foreliggende undersøgelse fastslog svækkelsen og efterfølgende genopretning af zebrafiskens svømmeadfærd efter læsion ved hjælp af den åbne felttest, hvorigennem to parametre, tilbagelagt afstand (cm) og gennemsnitshastighed (cm / s), blev kvantificeret. Bevægelseen blev vurderet ved at analysere optagelserne af individuelle fisk i hver gruppe (n = 6) ved hjælp af videosporingssoftware. Resultaterne viste en signifikant (p < 0,0001) reduktion i hastighed (cm / s) og tilbagelagt afstand (cm) af læsioned zebrafisk 3 dage efter lesion sammenlignet med sham. Den læsionerede zebrafisk udviste fuld genopretning af svømmeadfærd 30 dage efter førelsen. De foreliggende resultater tyder på, at 6-OHDA læsionerede voksne zebrafisk er en fremragende model med reproducerbar kvalitet for at lette undersøgelsen af neuroregenerering i PD. Fremtidige undersøgelser af de mekanismer, der ligger til grund for neuroregenerering samt indre og ydre faktorer, der modulerer processen, kan give vigtig indsigt i nye celleudskiftningsbehandlingsstrategier mod PD.

Introduction

Parkinsons sygdom (PD), en sygdom, der er karakteristisk karakteriseret ved muskelstivhed, hvilende rysten og bradykinesi, er den hurtigst voksende neurologiske sygdom i verden1,2. Risikoen og forekomsten af PD stiger hurtigt med alderen, især hos personer i alderen 50 år og derover3. PD's ætiologi og patogenese er hidtil fortsat dårligt forstået. Dette har ofte efterladt den tidlige begyndelse af PD udiagnosticeret. På nuværende tidspunkt er manglen på dopamin og tabet af dopaminerge neuroner (DpN) hos PD-patienter stærkt forbundet med manifestationen af motoriske symptomer4. Ved at udnytte dette forhold er flere behandlinger designet til enten at fungere direkte som dopaminerstatning (dvs. levodopa) eller for at kompensere for tabet af DpN (dvs. dyb hjernestimulering). Selv om disse behandlinger medfører symptomatiske fordele, ændrer de ikke sygdommens forværrede forløb5. I lyset af denne betydelige svaghed er celleerstatningsterapi blevet foreslået. Effektiviteten af denne tilgang er imidlertid inkonsekvent i betragtning af udfordringerne ved graftpræparation, cellevækstkontrol og fænotype ustabilitet. Celleerstatningsterapi, som havde rejst etiske bekymringer, udgør også risikoen for at fremkalde hjernetumorer og uønskede immunreaktioner6,7.

Begrænsningerne i de nuværende terapeutiske strategier har ført til en større vægt på regenerering af DpN som en potentiel tilgang til behandling af PD. Regenerering af DpN eller neuroregenerering har vist sig som et af de lovende gennembrud i forvaltningen af PD, ikke kun på grund af dets potentiale som en ny terapeutisk metode, men også som et middel til at forstå sygdommens mekanisme8, 9. Denne tilgang fokuserer på genoprettelsen af neuronal funktion gennem differentiering, migration og integration af eksisterende stamceller i det læsionerede kredsløb10. For yderligere at udforske neuroregenerering er der foretaget forskellige in vivo-undersøgelser. Det blev konstateret, at hvirveldyr som pattedyr, padder og krybdyr genererer nye hjerneceller efter skade11,12. Blandt hvirveldyrene er pattedyr mere eftertragtede i betragtning af deres genetiske lighed med mennesker. Pattedyr udviser imidlertid begrænset og dårlig reparativ kapacitet i centralnervesystemet (CNS), der kan vare gennem voksenalderen efter en hjernelæsion13. Generelt er pattedyr uegnede som dyremodeller til forståelse af neuroregenerering, da det lave antal neuroner, der produceres, ikke vil være tilstrækkeligt til at genoprette beskadigede neurale kredsløb observeret i PD. Som sådan er den teleostbaserede model, specifikt i zebrafisk, stærkt begunstiget for sin høje proliferative hastighed, evne til kontinuerligt at forny sig selv og lukke hjernehomologi med mennesker14,15.

Zebrafisk bruges oftest til at studere uordnet bevægelse i PD16. Den zebrafiskbaserede PD-model induceres normalt af neurotoksiner, som omfatter 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) og 6-hydroxydopamin (6-OHDA)17. Selvom de er effektive til at fremkalde specifikt tab af DpN og fald i dopaminniveauer, efterligner MPTP-baserede modeller ikke nøje betingelserne for PD, da DpN-tabet ikke kun er begrænset til CNS18. 6-OHDA's manglende evne til at krydse blod-hjerne-barrieren begrænsede dens virkninger på cellulære og funktionelle ændringer i hjernen, når den administreres intrakranielt i modsætning til intramuskulært19. Perifer administration af 6-OHDA forårsagede en global reduktion af dopaminniveauet i hele nervesystemet20. Mens administration af 6-OHDA i cerebrospinalvæsken forårsagede ablation af DpN i hele CNS21, som ikke efterligner tilstanden som set i PD, hvorved tabet af DpN forekommer specifikt ved substantia nigra i den menneskelige hjerne. ICV-administration af 6-OHDA inducerede tværtimod specifikt signifikant ablation af DpN i området ventral Dn i zebrafiskens hjerne, som lignede substantia nigra22. Interessant nok blev genopretning af DpN rapporteret 30 dage efter 6-OHDA-induceret læsion, og disse neuroner overlevede i løbet af livet23,24. Den funktionelle genopretning af DpN blev demonstreret gennem en lokomotorisk vurdering af tilbagelagt afstand (cm) og gennemsnitshastighed (cm/s) ved hjælp af den 6-OHDA-inducerede voksne zebrafiskbaserede PD-model22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse er godkendt af Udvalget for Dyreforskning og Etik (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Referencenr.: UiTM CARE 346/2021, dateret den 7. maj 2021].

BEMÆRK: De offentliggjorte protokoller22,25,26 for standardhold og vedligeholdelse af den 6-OHDA-læsionerede voksne zebrafisk PD-model blev anvendt. Eksperimenter blev udført med voksne mandlige zebrafisk (Danio rerio) i alderen mere end fem måneder gammel med en standardiseret længde på 3,2-3,7 cm.

1. Vedligeholdelse af zebrafisk og præ-ICV-mikroinjektionspræparater

  1. Fisken opbevares i en luftvandstank under en kontrolleret temperatur på 28 ± 1,0 °C. Til zebrafiskehold og vedligeholdelse skal der anvendes destilleret vand, der er mineraliseret med kommercielt havsalt (1 g/l) under hele forsøget27.
  2. Hus maksimalt 25 fisk pr. 45 L tank eller en fisk pr. 1,8 L vand og udsæt dem for en tidsplan på 14 timer lys og 10 timer mørk fotoophold. Foder fisken mindst to gange om dagen med madpiller suppleret med frysetørrede orme.
  3. En koncentreret stamopløsning af tricainmethansulfonat (MS-222) fremstilles ved at opløse 2,5 g MS-222 og 5 g natriumbicarbonat i 250 ml destilleret vand. Fortynd 2 ml stamopløsning for at producere 200 ml arbejdsbedøvelsesopløsning.
  4. Der fremstilles 99,96 mM 6-OHDA ved først at opløse 0,2 mg ascorbinsyre i 1 ml 0,9 % w/v sterilfiltreret NaCl. Opløsningen filtreres med 0,2 mikron filter, inden der tilsættes 25 mg 6-OHDA i pulverform i opløsningen. Opløsningen forberedes frisk før hver injektion, og den opbevares i mørke ved 4 °C.
    FORSIGTIG: Brug passende personlige værnemidler (dvs. handsker, laboratoriefrakke og ansigtsmaske) og øv god laboratoriepraksis ved håndtering af kemikalierne. Al håndtering af kemikalierne skal ske i et biosikkerhedsskab.

2. Anæstesi og ICV-injektion af zebrafisk

  1. Hurtig fisken i 24 timer for at undgå regurgitation under anæstesi. Bedøvelse af fisken ved at nedsænke den i en beholder indeholdende 0,01 % w/v MS-222-opløsning i ca. 1 min., eller indtil al synlig muskelbevægelse ophører.
  2. Placer den abesatte fisk på en vandgennemblødt svamp placeret under et stereomikroskop og våd fisken regelmæssigt.
  3. Identificer injektionspositionen baseret på skæringspunktet mellem metopisk sutur (MS), koronal sutur (CS) og sagittal sutur (SS), der forbinder zebrafiskhjernens frontale og parietale kranium.
  4. Lav et lille hul på 1,0 mm2 areal ved hjælp af en skarp 27 G nål i kraniet styret af den specifikke anatomiske position på zebrafiskens kranium (figur 1A,B).
  5. Sænk mikrokapillærinjektoren i en vinkel på 60°, indtil den når en dybde på 1.200 μm fra zebrafiskekraniets kraniale tag (figur 1C). Tryk på Z-grænsen for at rette positionen.
  6. Indstil det indledende injektionstryk til 4000 hPa og kompensationstrykket til 10 hPa. Indstil injektionens varighed til 0,3 s. Sænk intensiteten af injektionen med hver efterfølgende injektion.
  7. Injicer 0,5 μL 99,96 mM neurotoksin 6-OHDA (eller 0,9% w/v saltvand til sham-kontrolgruppe) og lad mikrokapillæren hvile i 20 s. Fortsæt med at vådte fisken med destilleret vand under hele injektionsprocessen for at forhindre udtørring.
  8. Fjern langsomt mikrokapillæren og genoplive fisken under rindende destilleret vand. Placer fisken i en isoleret genopretningstank, og fjern eventuelle distraktioner, der potentielt kan forstyrre genopretningsprocessen.
  9. Skyl mikrokapillæren inden næste injektion for at fjerne blokeringen og sikre, at injektionsintensiteten er tilstrækkelig til at give det ønskede volumen på 0,5 μL 6-OHDA.

Figure 1
Figur 1: Injektionssted for neurotoksin, 6-OHDA. (A) Punktet for mikrokapillær indgang styres af skæringspunktet mellem den metopiske sutur (MS), koronal sutur (CS) og sagittal sutur (SS), der forbinder zebrafiskhjernens frontale og parietale kranium (planvisning). (B) En skematisk tegning (planvisning) af zebrafiskens kranium og hjerne viser mikrokapillæren, som sænkes direkte over habenulaen (Hab), og dens indgangspunkt ved skæringspunktet mellem halvkugler. (C) En skematisk tegning (sagittal sektion) af zebrafiskens hjerne viser injektionsvinklen og penetrationsdybden. Den sorte prak repræsenterer det læsionerede sted, der er placeret over det målrettede område, den ventrale diencephalon. Forkortelser: 6-OHDA: 6-hydroxydopamin, CS: koronal sutur, Dn: diencephalon, Hab: habenula, Hyp: hypothalamus, MS: metopisk sutur, OB: olfaktorisk pære, POA: præoptisk område, PT: posterior tuberculum, SS: sagittal sutur, Tec: tectum og Tel: telencephalon. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Vurdering af lokomotor

BEMÆRK: Lokomotorisk vurdering af zebrafisk (n = seks / gruppe; sham vs læsioned) blev vurderet individuelt via open tank-testen ved hjælp af etablerede protokoller28,29 på dag tre og dag 30 efter 6-OHDA-læsion.

  1. Videooptagelse
    1. Placer forsøgstanken (længde 20 cm, bredde 11,5 cm, højde 13 cm) med væggene dækket af hvidt papir på en hævet platform (figur 2A).
    2. Belys tanken fra bunden ved hjælp af en lyskilde. Fyld tanken med destilleret vand (80% -90% fuld) og hold temperaturen på 28 ± 1,0 ° C. Mål temperaturen ved hjælp af et termometer og reguler det ved hjælp af en kommerciel akvarievarmer.
    3. Efter mindst 2 minutters akklimatisering skal du registrere fiskens svømmeadfærd fra en planvisning på det 2-dimensionelle (2D) plan i forsøgsarenaen ved hjælp af et videokamera i 5 minutter (figur 2B). For at undgå inkonsekvens i svømmeadfærden hos den tidligere og den sidste batch af optagelser må du ikke overskride akklimatiseringen med 10 min30.
    4. Analyser videoerne ved hjælp af videosporingssoftware med open tank-protokollen til erhvervelse af tilbagelagt afstand (cm) og gennemsnitshastighed (cm / s) for hvert emne.

Figure 2
Figur 2: Eksperimentel opsætning af en åben tanktest til vurdering af zebrafiskens bevægelsesadfærd. (A) Forsøgstanken (set forfra) placeres på en hævet platform, der belyses nedefra. Tankens fire vægge er dækket af hvidt papir, og optagelserne fanges aksialt. Temperaturen måles ved hjælp af et termometer og reguleres ved 28 ± 1,0 °C ved hjælp af en kommerciel akvarievarmer. (B) Skærmbillede (planvisning) af videooptagelse, der er optaget ved hjælp af opsætningen. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Analyse af data
    1. Dobbeltklik på ikonet for at åbne videosporingssoftwaren. Klik på fanen Filer, og vælg Opret nyt tomt eksperiment. Dette giver brugeren mulighed for at tilpasse eksperimentparametrene i henhold til undersøgelsens mål.
    2. Klik på fanen Protokol , vælg Videokilder, og klik på Tilføj ny videokilde. Klik på den tilgængelige rulleliste, og vælg videofil mulighed. Dette vil bede om pop op-vinduet til filbrowsing, hvorfra videooptagelserne af interesse kan vælges.
    3. Klik på underfanen Apparat, og vælg ikonet Rektangulær for at konfigurere apparatet. Træk det rektangulære ikon for at dække hele den eksperimentelle arena. Indstil skalalinjen i overensstemmelse hermed, og indtast den numeriske værdi af den skalamåling, der bruges i længden af linealsektionen. Det foreliggende eksperiment brugte en 10 mm skala til den åbne tanktest.
    4. Indstil dyrefarven ved at vælge Dyrene er mørkere end Apparatets baggrund. Overlad de andre tilgængelige indstillinger i Sporing til de forudindstillede standardindstillinger.
    5. Klik på det tidligere tegnede apparat i underfanen Zoner . Denne zone er indstillet som standardzone, hvor positionen er den samme for alle tests.
    6. Vælg følgende indstillinger under Testplanlægning og testdatarapport: Testvarighed, Samlet tilbagelagt distance og Gennemsnitshastighed. Andre tilgængelige tests på listen er valgfrie og afhængige af forskerens undersøgelsesinteresse.
    7. Under fanen Forsøg skal dyrene tildeles i henhold til deres testgruppe ved at indtaste gruppenavnet under afsnittet Navn og antallet af dyr pr. gruppe i afsnittet Antal dyr .
    8. Skift til fanen Test for at køre eksperimentet. Klik på ikonet Start test, og vent, indtil alle videoer er analyseret.
    9. Under fanen Resultater skal du klikke på ikonet Vis rapporten for at få vist de lokomotoriske data i tekstrapportformularen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det foreliggende forsøg vurderede ændringerne i voksne zebrafisks svømmeadfærd efter ICV-mikroinjektion med 6-OHDA. Årsagen til at bruge 6-OHDA som det valgte neurotoksin skyldtes dets manglende evne til at krydse blod-hjerne-barrieren, som producerede specifik og målrettet ablation af DpN inden for området interesse-ventral diencephalon (Dn)16. DpN-underpopulationen her har anatomisk lighed med DpN-underpopulationen i menneskets substantia nigra pars compacta31.

I henhold til vores tidligere arbejde22 blev den cellulære virkning af 6-OHDA ICV-mikroinjektion mod DpN hos voksne zebrafisk bekræftet ved immunohistostainering af DpN-markør-tyrosinhydroxylase (TH). Den vigtigste hjerneregion af interesse var Dn, der består af det præoptiske område (POA), posterior tuberculum (PT) og hypothalamus (Hyp). Det blev konstateret, at 99,96 mM 6-OHDA resulterede i en 100% overlevelsesrate for den voksne zebrafisk med det laveste antal TH-immunoreaktive (TH-ir) i Dn. Det blev også konstateret, at mere end 85% (p < 0,01) af TH-ir DpN i Dn blev ableret på dag tre postlesion. Antallet af TH-ir DpN steg derefter med mere end 50% på dag 14 postlesion, før der opnås fuld regenerering 30 dage efter udsættelse (figur 3). Disse data understøtter dpN-subpopulationens regenerative kapacitet i Dn af voksne zebrafisk efter ablation32.

Figure 3
Figur 3: Regenerering af DpN i Dn-regionen af zebrafisk læsioneret med 99,96 mM 6-OHDA. (A) Antallet af TH-ir DpN i tre hovedområder i Dn-regionen, POA, PT og Hyp, over fire datapunkter: sham, 3, 14 og 30 dage efter læsion med 99,96 mM 6-OHDA neurotoksin. Hver bjælke repræsenterer middelværdi ± SD på n = 6 uafhængige eksperimenter; *p < 0,05. (B) Repræsentative konfokale mikroskopbilleder af sagittalt sektioneret zebrafisk hjerne af sham (I, I' og I''), 3 dage efter læsion (II, II' og II''), 14 dage efter læsion (III, III' og III'') og 30 dage efter læsion (IV, IV' og IV'') farvet med TH (DpN; grøn) og DAPI (kerner; blå). Skalastang = 50 μm. Forkortelser- DAPI: 4′, 6-diamidino-2-phenylindol, 6-OHDA: 6-hydroxydopamin, Dn: diencephalon, DpN: dopaminerge neuroner, Hyp: hypothalamus, POA: præoptisk område, PT: posterior tuberculum, SD: standardafvigelse og TH-ir: tyrosinhydroxylase immunoreaktiv. Tilpasset fra Vijayanathan et al.22. Klik her for at se en større version af denne figur.

Vi udførte derefter bevægelsesmotorisk vurdering ved hjælp af den åbne tanktest for at undersøge ændringer i tilbagelagt afstand (cm) og gennemsnitshastighed (cm / s) for voksne zebrafisk efter ICV-mikroinjektion af 6-OHDA og sham. Forsøgsfisk blev derefter vurderet på dag tre postlesion (mindst antal TH-ir DpN observeret) og dag 30 postlesion (fuldt restaureret DpN rapporteret på læsionsstedet). Analyse af zebrafiskens svømmeadfærd ved hjælp af en videosporingssoftware viste, at både gennemsnitshastigheden (cm / s) og den tilbagelagte afstand (cm) for den læsionerede gruppe på dag tre postlesion blev signifikant reduceret (p < 0,001) til <45% sammenlignet med sham (figur 4). Den læsionerede gruppe udviste genopretning af motorisk funktion 30 dage efter udstødelsen uden nogen signifikant forskel på både gennemsnitshastigheden (cm / s) og den tilbagelagte afstand (cm) sammenlignet med sham.

Figure 4
Figur 4: Ændringer i svømmeadfærd efter intracerebroventrikulær injektion ved 6-OHDA. Svømmeadfærd hos voksne zebrafisk blev vurderet før læsion, på dag tre og dag 30 postlesion med 99,96 mM 6-OHDA. De parametre, der blev vurderet, omfattede: (A) gennemsnitshastighed (cm/s) og (B) tilbagelagt afstand (cm). Hver stang repræsenterer gennemsnitlig ± SD på seks fisk; p < 0,0001 (Student t-test). Forkortelser: 6-OHDA: 6-hydroxydopamin, SD: standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det foreliggende arbejde demonstrerede med succes den lokomotoriske vurdering af den etablerede 6-OHDA-inducerede, voksne zebrafiskbaserede PD-model. Hele eksperimentet involverede tre hovedtrin: præ-ICV mikroinjektionspræparater, ICV mikroinjektion af zebrafisk og lokomotorisk vurdering. For at sikre en sund genopretning af voksne zebrafisk efter ICV-mikroinjektionsproceduren og et godt eksperimentelt resultat er der i denne undersøgelse blevet anbefalet nogle gode fremgangsmåder for hvert trin.

Præ-ICV mikroinjektionsforberedelse: Dyreudvælgelse blev bedst udført dagen før forsøget. Kønnet blev identificeret, og fiskens længde blev målt. Mandlig voksen zebrafisk med en standardiseret længde på 3,2-3,7 cm blev anbragt i en separat forsøgstank. Derudover bør fiskene gennemgå en fasteperiode på 24 timer for at undgå gylp under bedøvelse33. En akvarium (med sine fire vægge dækket af hvidt papir) med en stående vandtank oprettet bør forberedes før eksperimentet for at mindske den udvendige belastning og hjælpe zebrafiskens genopretningsproces. Alle kemikalier blev tilberedt på frisk inden starten af hvert forsøg, da de kunne forringes hurtigt over tid og blive ustabile ved stuetemperatur34,35.

Mikroinjektion af 6-OHDA:Ren og skånsom håndtering af zebrafisk bør udføres under hele processen for at forhindre, at fisken opstår unødvendig skade og infektion. Fisken skal placeres oven på en våd svamp og holdes i fugtig tilstand for at undgå udtørring36. Et lille snit blev lavet ved hjælp af en steril nål med fast og passende kraft for at undgå ekstra tryk, der kan knække zebrafiskens kranium. Dette snit skal tillade indtrængen af mikrokapillæren i hjernehulen. Mikrokapillæren blev derefter sænket til en dybde på 1.200 μm fra indgangspunktet, som er mellem to halvkugler - telencephalon og tectum (figur 1B,C). Indgangspunktet blev valgt mellem disse halvkugler for at forhindre yderligere laceration af neuroner37. Denne teknik involverede brugen af en mikroinjektor, trykket og timingen af leveringen skal kalibreres for at sikre levering af 0,5 μL neurotoksin. Denne kalibrering kan udføres ved at måle størrelsen på dråben, der dannes på filterpapiret38. Vores praksis involverede normalt følgende opsætning af programmerbare parametre, hvorved injektionsintensiteten blev sænket med hver efterfølgende injektion (injektionstryk: 4000 hPa, injektionsvarighed: 0,3 s og kompensationstryk: 10 hPa). For at undgå, at neurotoksinet siver ud af hjernehulen, blev der anvendt et interval på 20 s mellem injektion og tilbagetrækning af mikrokapillæren35. På grund af kapillærens lille størrelse kan mikrokapillæren blokeres efter hver injektion. Som sådan bør mikrokapillæren i det væsentlige skylles inden den næste injektion for at fjerne blokeringen og sikre, at injektionsintensiteten er tilstrækkelig til at give det ønskede volumen på 0,5 μL 6-OHDA. Fiskene vil derefter blive overført til en bjærgningstank, der opretholdes ved 28 ± 1,0 °C. Hvis fisken ikke kommer sig inden for 30 s, skylles gællen og munden ud med destilleret vand, indtil der sker fuld genopretning af muskelbevægelser.

Lokomotorisk vurdering: For at sikre en god lokomotorisk vurdering på 6-OHDA-induceret voksen zebrafisk, bør adfærdsundersøgelsen udføres inden for samme tidsramme for hvert tidspunkt. Hver adfærdsundersøgelse skal give mulighed for mindst 2 minutters akklimatiseringsperiode og skal udføres inden for 4 timer 39. Det foreliggende forsøg blev udført tidligt om morgenen mellem kl. 8 og 12, da zebrafisk var mere aktive i denne periode40. En længere akklimatiseringsperiode er nødvendig, hvis zebrafisk viser unormal adfærd med klare tegn på stress og angst (frysning og uregelmæssig adfærd)41. For at undgå inkonsekvens i svømmeadfærden hos den tidligere og den sidste batch af optagelser bør akklimatiseringen dog ikke overstige 10 min30. Til den åbne felttest kan en eksperimentel tank af enhver størrelse, farve, form og tekstur bruges til optagelser, der spænder fra mindst 5 til 30 min42,43. Zebrafiskens adfærd påvirkes i høj grad af temperaturen i omgivelserne. Små udsving på mere end 4 °C kan i høj grad påvirke svømmehastigheden44. Derfor bør temperaturen på vandet i forsøgstanken holdes strengt under en kontrolleret temperatur på 28 ± 1,0 °C ved hjælp af en kommerciel varmelegeme, og vandstanden blev holdt omkring 12 cm dyb under hele forsøget. Tankens vægge blev dækket af hvidt papir for at skabe kontrast mellem forsøgspersonen og forsøgsarenaen samt for at reducere eksterne stimuli, der kan forårsage en uopfordret reaktion fra forsøgspersoner45. Fiskene fra hver gruppe blev testet individuelt i overensstemmelse med den nuværende standardpraksis for zebrafisk neuroadfærdsmæssig forskning23,37,46. I betragtning af zebrafiskens tilbøjelighed til sociale interaktioner er der bekymring for, at isolation i testperioden kan påvirke deres adfærd47. Den nuværende forsøgsopstilling var dog begrænset til maksimalt 10 min pr. forsøg, og denne korte isolationsperiode viste sig ikke at have nogen effekt på den lokomotoriske aktivitet hos voksne zebrafisk48. For at give nøjagtig dataindsamling til adfærdsundersøgelsen blev vurderingen udført ved tilfældigt at udvælge zebrafisken fra forskellige eksperimentelle grupper (dvs. skiftevis to zebrafisk fra enten sham- og 6-OHDA-læsionsgruppen indtil n = 6) under den åbne tanktest49. De optagede videoer blev analyseret ved hjælp af et videosporingssystem, der almindeligvis bruges til gnaveres adfærdsmæssige sporing. Da zebrafisk er en fremspirende dyremodel, er de adfærdstests, der udføres ved hjælp af zebrafisk, normalt tilpasset fra den etablerede videnskabelige litteratur om gnavere50. Her demonstrerede vi videosporingssoftwarens evne til automatisk at spore zebrafisk i den eksperimentelle arena og effektivt beregne de ønskede parametre. Videosporingssoftwaren skilte sig ud fra den anden tilgængelige software på grund af de mange forskellige videofiler, der understøttes af softwaren, regelmæssige opdateringspakkeudgivelser og support til forskellige operativsystemer51.

En af begrænsningerne ved eksisterende dyrebaserede PD-modeller er manglen på mekanistiske ligheder, der efterligner den motoriske svækkelse som observeret efter dopaminerg neuronalt tab i substantia nigra pars compacta i den menneskelige hjerne52. Fremkomsten af den voksne zebrafiskbaserede PD-model kan dog afhjælpe denne særlige begrænsning. Som observeret i denne undersøgelse svarede den reducerede svømmehastighed til vores tidligere cellulære fund, hvorved mere end 85% dopaminerg neuronalt tab i den ventrale diencephalon af 6-OHDA-induceret voksen zebrafisk model tre dage efter lesion22. Det ser ud til, at specifik ablation af dopaminerge neuroner i dette interesseområde er nødvendig for at forstyrre den faldende motoriske signalering fra hjernen, hvilket forårsager langsommelighed i bevægelse53. L. J. Caldwell, et al.23, der udførte ICV-injektion af 6-OHDA ved det optiske tectum (indgangssted), observerede for eksempel kun ændringer i zebrafiskstimering og parringsadfærd. Ablation af DpN i ventral Dn er afgørende, da populationen af DpN i Dn af voksne zebrafisk fungerer som den eneste dopaminkilde til zebrafiskmotorneuroner. Dette er analogt med den menneskelige substantia nigra54. Den foreliggende undersøgelse observerede også hurtigere svømmehastighed og længere afstand tilbagelagt af læsioned zebrafisk i senere postlesionstidspunkter, hvilket indikerer fortsat og i sidste ende fuld restaurering af dopaminsignalering, der styrer zebrafiskens svømmeadfærd. Disse resultater validerede således evnen hos nyligt regenererede dopaminerge neuroner til at genvinde deres funktionelle aktiviteter i læsionerede voksne zebrafisk.

Den nuværende applikationsrute for 6-OHDA involverede et let invasivt injektionsparadigme, der krævede indsættelse af mikrokapillær dybt ind i hjernen mod læsionsområdet af ventral Dn. Denne metode er lidt besværlig i forhold til perifer injektion og skal udføres inden for 3 minutter pr. Fisk for at reducere risikoen for dødelighed efter injektion. Som sådan kræves forudgående praksis med ICV-injektion for at sikre, at metoden kan udføres inden for den kritiske varighed på det målrettede område (Dn). For at opnå en gyldig lokomotorisk vurdering af voksne zebrafisk er testen med åbne akvarium begrænset til kun 4 timers vurderingsperiode pr. dag. Der kræves derfor forudgående planlægning inden for en forsøgsramme, der involverer et stort antal dyr, hvorved der bør afsættes ekstra tid for at sikre, at opsætningen opfyldte minimumskravene for hver registrering (f.eks. temperatur og vanddybde). Denne planlægning er især afgørende i tidsbaserede eksperimenter som den aktuelle undersøgelse, da hver optagelse skal udføres på det tilsigtede tidspunkt. Det nuværende forsøgssetup var begrænset til studiet af to svømmeparametre, der specifikt vurderede zebrafiskens motoriske funktion. Andre adfærdsparametre som shoaling og angstlignende adfærd krævede imidlertid andre eksperimentelle opsætninger og forskellige analytiske metoder. Sammenfattende er dette en reproducerbar og nyttig metode til at studere DpN-neuroregenereringsprocessen i 6-OHDA-induceret voksen zebrafisk, som kan give vigtig indsigt i celleudskiftningsbehandlingsstrategier mod PD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videregående Uddannelse Malaysia under Grundforskningstilskudsordningen [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) Sigma-Aldrich, Missouri, USA 162957
Ascorbic acid Thermo Fisher Scientific, California, USA FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL Thermo Fisher Scientific, California, USA FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL Eppendorf, Hamburg, Germany 30124332
Nice conical flask, 100 mL Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Missouri, USA P4417
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Missouri, USA S5761
Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 106404
Stereomicroscope Nikon, Tokyo, Japan SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich, Missouri, USA E10521
Equipment
ANY-maze software Stoelting Co., Illinois, USA - version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance Sartorius, Göttingen, Germany SE 2
FemtoJet IV microinjector Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary Eppendorf, Hamburg, Germany 5242957000
InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000027
LED Portable Lamp MR. DIY, Selangor, Malaysia 9023251 20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips Ted Pella, California, USA 5367-12NM
Shanda aquarium heater Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia SDH-228
Thermometer Sera Precision, Heinsberg, Germany 52525
Video camera Nikon, Tokyo, Japan D3100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L. Estimation of the 2020 global population of Parkinson's Disease (PD). Movement Disorder Council. 35 (1), 198 (2020).
  3. Hirsch, L., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T., Pringsheim, T. The Incidence of Parkinson's Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology. 46 (4), 292-300 (2016).
  4. Przedborski, S. The two-century journey of Parkinson disease research. Nature Review Neuroscience. 18 (4), 251-259 (2017).
  5. Cookson, M. R. Disease-Modifying Targets in Neurodegenerative Disorders. , Academic Press. Ch. 6 157-174 (2017).
  6. Jamebozorgi, K., et al. Cellular and molecular aspects of Parkinson treatment: Future therapeutic perspectives. Molecular Neurobiology. 56 (7), 1-13 (2018).
  7. Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Review Neuroscience. 21 (1), 1-13 (2020).
  8. Foltynie, T. Can Parkinson's disease be cured by stimulating neurogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 978-980 (2015).
  9. Winner, B., Winkler, J. Adult neurogenesis in neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbour Perspect Biology. 7 (4), 021287 (2015).
  10. Huang, C., et al. Nerve guidance conduits from aligned nanofibers: improvement of nerve regeneration through longitudinal nanogrooves on a fiber surface. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (13), 7189-7196 (2015).
  11. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  12. Dietz, V., Schwab, M. E. From the rodent spinal cord injury model to human application: promises and challenges. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1826-1830 (2017).
  13. La Rosa, C., Bonfanti, L. Brain plasticity in mammals: An example for the role of comparative medicine in the neurosciences. Frontiers in Veterinary Science. 5 (274), 1-8 (2018).
  14. Ferretti, P., Prasongchean, W. Neural Stem Cells in Development, Adulthood and Disease. , Springer. 1-21 (2015).
  15. Vijayanathan, Y., et al. Adult endogenous dopaminergic neuroregeneration against Parkinson's Disease: Ideal animal models. Neurotoxicity Research. 39 (2), 504-532 (2021).
  16. Vaz, R. L., Outeiro, T. F., Ferreira, J. J. Zebrafish as an animal model for drug discovery in Parkinson's disease and other movement disorders: a systematic review. Frontier Neuroscience. 9, 347 (2018).
  17. Nie, S., et al. Small molecule TrkB agonist deoxygedunin protects nigrostriatal dopaminergic neurons from 6-OHDA and MPTP induced neurotoxicity in rodents. Neuropharmacology. 99, 448-458 (2015).
  18. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
  19. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24 (4), 308-318 (2002).
  20. Anichtchik, O. V., Kaslin, J., Peitsaro, N., Scheinin, M., Panula, P. Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6-hydroxydopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Journal of Neurochemistry. 88 (2), 443-453 (2004).
  21. Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. d Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
  22. Vijayanathan, Y., et al. 6-OHDA-lesioned adult zebrafish as a useful Parkinson's disease model for dopaminergic neuroregeneration. Neurotoxicity Research. 32 (3), 496-508 (2017).
  23. Caldwell, L. J., et al. Regeneration of dopaminergic neurons in adult zebrafish depends on immune system activation and differs for distinct populations. Journal of Neuroscience. 39 (24), 4694-4713 (2019).
  24. Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. Journal of Comparative Neurology. 488 (3), 290-319 (2005).
  25. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture Research. 269 (1-4), 1-20 (2007).
  26. Reed, B., Jennings, M. Guidance on the Housing and Care of Zebrafish Danio rerio. Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA). , 7-53 (2011).
  27. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  28. Altenhofen, S., et al. Tebuconazole alters morphological, behavioral and neurochemical parameters in larvae and adult zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 180, 483-490 (2017).
  29. Bridi, D., Altenhofen, S., Gonzalez, J. B., Reolon, G. K., Bonan, C. D. Glyphosate and Roundup alter morphology and behavior in zebrafish. Toxicology. 392, 32-39 (2017).
  30. Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nature Protocols. 1 (4), 1828-1831 (2006).
  31. Pienaar, I. S., Götz, J., Feany, M. B. Parkinson's disease: insights from non-traditional model organisms. Progress in Neurobiology. 92 (4), 558-571 (2010).
  32. Becker, T., Becker, C. G. Axonal regeneration in zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 27, 186-191 (2014).
  33. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
  34. Katz, E. M., et al. The stability and efficacy of tricaine methanesulfonate (MS222) solution after long-term storage. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (4), 393-400 (2020).
  35. Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
  36. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, analgesia, anesthesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. 50 (4), 343-360 (2009).
  37. Barbosa Júnior, A., et al. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Springer. 323-330 (2012).
  38. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e4434 (2013).
  39. Stewart, A., et al. Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology. 62 (1), 135-143 (2012).
  40. Sykes, D. J., Suriyampola, P. S., Martins, E. P. Recent experience impacts social behavior in a novel context by adult zebrafish (Danio rerio). PLOS ONE. 13 (10), 0204994 (2018).
  41. Collymore, C., Tolwani, R. J., Rasmussen, S. The behavioral effects of single housing and environmental enrichment on adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (3), 280-285 (2015).
  42. Grossman, L., et al. Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behavioural Brain Research. 214 (2), 277-284 (2010).
  43. Stewart, A., et al. Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behavioural Processes. 85 (2), 198-203 (2010).
  44. Abozaid, A., Tsang, B., Gerlai, R. The effects of small but abrupt change in temperature on the behavior of larval zebrafish. Physiology and Behavior. 227, 113169 (2020).
  45. Sekhar, M., Singh, R., Bhat, A., Jain, M. Feeding in murky waters: acclimatization and landmarks improve foraging efficiency of zebrafish (Danio rerio) in turbid waters. Biology Letters. 15 (7), 1-5 (2019).
  46. Valcarce, D. G., Martínez-Vázquez, J. M., Riesco, M. F., Robles, V. Probiotics reduce anxiety-related behavior in zebrafish. Heliyon. 6 (5), 03973 (2020).
  47. Tunbak, H., Vazquez-Prada, M., Ryan, T. M., Kampff, A. R., Dreosti, E. Whole-brain mapping of socially isolated zebrafish reveals that lonely fish are not loners. eLife. 9, 55863 (2020).
  48. Shams, S., Seguin, D., Facciol, A., Chatterjee, D., Gerlai, R. Effect of social isolation on anxiety-related behaviors, cortisol, and monoamines in adult zebrafish. Behavioral Neuroscience. 131 (6), 492-504 (2017).
  49. Burghardt, G. M., et al. Perspectives - Minimizing observer bias in behavioral studies: A review and recommendations. Ethology. 118 (6), 511-517 (2012).
  50. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  51. Franco-Restrepo, J. E., Forero, D. A., Vargas, R. A. A review of freely available, open-source software for the automated analysis of the behavior of adult zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 223-232 (2019).
  52. Beal, M. F. Parkinson's disease: a model dilemma. Nature. 466 (7310), 8-10 (2010).
  53. Jha, U., Thirumalai, V. Neuromodulatory selection of motor neuron recruitment patterns in a visuomotor behavior increases speed. Current Biology. 30 (5), 788-801 (2020).
  54. Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Developmental Cell. 25 (5), 478-491 (2013).

Tags

Neurovidenskab udgave 178
Lokomotorisk vurdering af 6-hydroxydopamin-induceret voksen zebrafisk-baseret Parkinsons sygdomsmodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Md Hamzah, N., Lim, S. M.,… More

Md Hamzah, N., Lim, S. M., Vijayanathan, Y., Lim, F. T., Abdul Majeed, A. B., Tan, M. P., Ramasamy, K. Locomotor Assessment of 6-Hydroxydopamine-induced Adult Zebrafish-based Parkinson's Disease Model. J. Vis. Exp. (178), e63355, doi:10.3791/63355 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter