Summary
Le protocole décrit une modification de la méthode rapide de Golgi, qui peut être adaptée à n’importe quelle partie du système nerveux, pour colorer les neurones de l’hippocampe et du cortex préfrontal médian du rat.
Abstract
L’imprégnation golgi, utilisant le kit de coloration Golgi avec des adaptations mineures, est utilisée pour imprégner les épines dendritiques dans l’hippocampe du rat et le cortex préfrontal médian. Cette technique est une amélioration marquée par rapport aux méthodes précédentes d’imprégnation de Golgi car les produits chimiques prémélangés sont plus sûrs à utiliser, les neurones sont toujours bien imprégnés, il y a beaucoup moins de débris de fond et, pour une région donnée, il existe des écarts extrêmement faibles dans la densité de la colonne vertébrale entre les expériences. De plus, les cerveaux peuvent être accumulés après un certain point et conservés congelés jusqu’à un traitement ultérieur. En utilisant cette méthode, toute région du cerveau d’intérêt peut être étudiée. Une fois tachée et recouverte glissée, la densité de la colonne vertébrale dendritique est déterminée en comptant le nombre d’épines pour une longueur de dendrite et exprimée en densité de colonne vertébrale par dendrite de 10 μm.
Introduction
La méthode d’utilisation du dichromate de potassium et du nitrate d’argent pour marquer les neurones a été décrite pour la première fois par Camillo Golgi 1,2 et ensuite utilisée par Santiago Ramon y Cajal pour produire un immense corpus de travaux différenciant les sous-types neuronaux et gliaux. Un livre récemment publié avec ses illustrations est maintenant disponible3. Suite aux études de Ramon y Cajal, qui ont été publiées il y a plus de 100 ans, très peu d’imprégnation Golgi a été utilisée. L’imprégnation de Golgi est un processus laborieux qui permet la visualisation tridimensionnelle des neurones avec un microscope optique. Il y a eu de nombreuses modifications de la méthode Golgi au fil des ans pour rendre la méthode plus facile et la coloration plus cohérente4. En 1984, Gabbott et Somogyi5 ont décrit la procédure d’imprégnation golgi à section unique qui a permis un traitement plus rapide. Cette méthode d’imprégnation de Golgi nécessite une perfusion avec 4% de paraformaldéhyde et 1,5% d’acide picrique, post-fixation suivie d’une coupe vibratome dans un bain de dichromate de potassium à 3%. Les sections sont montées sur des lames de verre, les quatre coins des couvercles collés de sorte que lorsqu’ils sont immergés dans du nitrate d’argent, la diffusion est progressive. Les couvercles sont ensuite enlevés, les sections sont déshydratées et finissent par glisser définitivement avec un support de montage. Cette technique a été utilisée avec succès pour marquer les neurones et la glie 6,7,8 dans l’hippocampe. La méthode rapide de Golgi décrite ici est une amélioration car il y a beaucoup moins d’exposition au dichromate de potassium et au nitrate d’argent et aucun paraformaldéhyde et acide picrique ne sont utilisés. De plus, bien que les cellules imprégnées à l’aide de modifications de la méthode Gabbott et Somogyi5 puissent être analysées, les sections étaient souvent surexposées ou sous-exposées ou tombaient des lames pendant l’étape de déshydratation et généralement, plusieurs expériences devaient être regroupées pour avoir suffisamment de cellules pour l’analyse.
Le présent protocole décrit l’utilisation du kit de coloration golgi (voir Tableau des matériaux) pour étiqueter les dendrites et les épines dendritiques dans l’hippocampe et le cortex préfrontal médian (mPFC) du rat. Les avantages de cette méthode par rapport aux précédentes sont qu’elle est rapide, qu’il y a moins d’exposition aux produits chimiques nocifs pour le chercheur et qu’il y a une coloration constante des neurones. Le protocole décrit ci-dessous a été utilisé avec des modifications mineures pour évaluer la densité de la colonne vertébrale dendritique dans l’hippocampe et le mPFC du rat dans de nombreuses études 9,10,11,12,13,14,15.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales sont approuvées par le Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee et sont conformes au NIH Guide for the Care and Use of Animals.
1. Isolement et infiltration du tissu cérébral
- Prémélanger les solutions A et B du kit de coloration Golgi 24 h avant utilisation et conserver dans des bouteilles sombres et/ou dans l’obscurité. Faire environ 80 mL de solution A et B mélange qui est suffisant pour changer la solution après 24 h. Conserver dans des bouteilles hermétiques.
REMARQUE: La perfusion avec une solution saline ou du paraformaldéhyde n’est pas nécessaire. - Sacrifiez les rats par guillotine après l’euthanasie au dioxyde de carbone et enlevez les cerveaux en quelques secondes. Rincer les cerveaux dans une solution saline si nécessaire, mais n’est pas nécessaire.
- Placez le cerveau, le cortex vers le bas pour que l’hypothalamus soit visible car les coupures sont faites antérieurement et postérieurement à celui-ci, sur une surface non poreuse. Coupé dans un bloc antérieur (contient le cortex préfrontal) et postérieur (contient l’hippocampe) comme le montre la figure 1.
- Placez les blocs dans les solutions prémélangées de A et B, en vous assurant qu’ils sont bien immergés dans la solution. Assurez-vous que le volume des solutions A et B est suffisant pour immerger les blocs. Conservez les blocs dans des bouteilles brunes ou des bouteilles transparentes recouvertes de papier d’aluminium (pour empêcher la lumière d’entrer) dans l’obscurité à température ambiante.
- Remplacer la solution après 24 h et conserver dans l’obscurité pendant encore 13 jours à température ambiante.
REMARQUE: S’il est utilisé avec des cerveaux de souris, il n’est pas nécessaire de bloquer et le cerveau entier peut être placé dans la solution. Si vous colorez des zones du cerveau de taille différente, le temps passé dans les solutions A et B peut devoir être déterminé par essais et erreurs. - Après deux semaines, le tissu est bien infiltré avec les solutions A et B, transférer les blocs dans la solution cryoprotectrice (solution C dans le kit de coloration golgi) et les laisser pendant 48-72 h à 4 °C.
REMARQUE: Après cryoprotection, les blocs peuvent être congelés jusqu’à un traitement ultérieur. Notez également que toutes les solutions du kit sont collectées et éliminées en tant que déchets dangereux. - Gelez le cerveau, le cortex vers le bas, sur une lame de verre sur de la glace sèche. Une fois congelé, coupez sur le cryostat ou conservez à -80 °C jusqu’à sectionnement à l’aide d’un cryostat.
REMARQUE: Ne pas congeler dans l’azote liquide car cela produit des fissures dans les tissus.
2. Sectionnement des tissus cérébraux
- Placez une petite quantité de milieu tissulaire sur un mandrin de cryostat pré-refroidi. Montez des blocs sur des mandrins de cryostat en décongelant un côté du bloc légèrement à la main (ganté) et en le plaçant sur le milieu tissulaire.
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’intégrer le tissu. Le bloc contenant l’hippocampe est un peu plus facile à couper que le bloc avec le cortex préfrontal car ce dernier est antérieur au corps calleux et les deux moitiés sont séparées. - Couper des sections de 100 μm sur un cryostat à -22 °C et les monter sur des lames de sous-lit. Des sections jusqu’à 150 μm d’épaisseur peuvent être utilisées. Essayez de monter 3-4 sections coronales par diapositive, car cela réduit le nombre de diapositives à traiter. Utilisez l’une des techniques suivantes pour garder les sections gelées jusqu’à ce qu’elles arrivent sur la diapositive.
REMARQUE: Ces sections ne sont pas fixées de la manière habituelle et ont donc tendance à fondre rapidement. Laissez les sections fondre sur la diapositive. S’ils commencent à fondre avant d’être placés sur la glissière, il est impossible de les faire tomber à plat sur la glissière. Il existe plusieurs techniques pour ce faire.- Utilisez un spray de congélation sur le couteau et le bloc. Selon la température et l’humidité dans la pièce, cela peut être nécessaire pour chaque section. Utilisez la plaque antiroulis ou une brosse pour garder la section à plat pendant la coupe.
REMARQUE: Assurez-vous d’avoir suffisamment de spray de congélation. Plusieurs boîtes peuvent être utilisées lors de la coupe de 20 blocs. - Montez le dégel, si possible, à l’aide d’une glissière à température ambiante et l’apposez-la rapidement dans la section. Avec de la pratique, on peut monter plusieurs sections à la fois. Si cela ne fonctionne pas, gardez les glissières dans le cryostat pour qu’elles soient très froides et transférez la section avec une pince froide ou un pinceau froid, puis décongelez le support.
- Utilisez un spray de congélation sur le couteau et le bloc. Selon la température et l’humidité dans la pièce, cela peut être nécessaire pour chaque section. Utilisez la plaque antiroulis ou une brosse pour garder la section à plat pendant la coupe.
- Nettoyez le couteau avec des lingettes en papier entre les tranches. Si le couteau nécessite plus de nettoyage, utilisez 100% d’éthanol (EtOH) et laissez-le sécher avant de couper la tranche suivante.
- Une fois montée sur la glissière, placez la glissière à plat sur des plateaux en carton et laissez sécher les sections à température ambiante (pendant plusieurs heures jusqu’à un maximum de 48 h) dans l’obscurité. Ne couvrez pas le plateau de diapositives. Assurez-vous que les sections sont complètement sèches avant l’imprégnation golgi. Conserver à plat, dans l’obscurité, sur des plateaux coulissants jusqu’à l’imprégnation de Golgi.
REMARQUE: Le séchage des sections ne cause aucun dommage.
3. Coloration et déshydratation du tissu cérébral
- Effectuer la coloration dans les plats de teinture de verre. Mélanger les solutions D et E immédiatement avant la coloration. Conformément au protocole, ajouter une partie de la solution D, une partie de la solution E et deux parties d’eau distillée. Pour les plats de teinture en verre, faites une solution de 200 mL pour immerger complètement les sections. Pour les pots Koplin, cela nécessite moins de volume.
- Placez les diapositives dans des racks suffisamment espacés pour permettre à la solution d’accéder aux sections.
- Placer les sections dans de l’eau distillée pendant 4 min (2x) avant de les placer dans la solution de coloration par imprégnation Golgi pendant 10 min. Changez la solution de coloration toutes les 70 sections. Changez l’eau distillée lorsqu’elle jaunit.
REMARQUE: Le moment de l’étape de coloration est critique. Trop court ne permet pas assez de coloration et trop long provoque une coloration excessive, ce qui rend les dendrites difficiles à séparer lors de l’analyse. Une fois sorti de la solution de coloration, le moment est moins critique. - Déshydratez les sections comme suit: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), agent de compensation (5 min; 3x). Changez souvent toutes les solutions, en particulier l’EtOH 100% et l’agent de compensation pour vous assurer que les sections restent anhydres.
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de passer par une étape EtOH de 50%. La contre-coloration n’est pas nécessaire pour la visualisation cellulaire car l’imprégnation de Golgi offre un contraste suffisant. L’utilisation d’autres agents de compensation n’a pas fonctionné aussi bien que celle utilisée ici (voir tableau des matières). - Couvercle avec des couvercles en verre de 60 mm de long avec une quantité généreuse de support de montage. Assurez-vous qu’il y a le moins de bulles d’air possible. Si nécessaire, retirez soigneusement et refaites le couvercle (peut être fait même des semaines plus tard). Faites-le très lentement afin de ne pas endommager la section (peut être fait en raison de la grande quantité de support de montage).
REMARQUE: Une grande quantité de support de montage est quelque peu salissante mais toujours nécessaire car suffisamment de support de montage doit être utilisé pour couvrir les sections épaisses de 100 μm. - Pour vous assurer qu’un seul couvercle est placé sur les sections, séparez les couvercles avant le processus.
- Une fois la couverture glissée, les lames sèches à plat sur tout papier non poreux pendant 3 à 5 jours, en les déplaçant légèrement, surtout après le premier jour, pour éviter de coller. Après 3-5 jours, transférez les diapositives sur des supports de diapositives et, idéalement, des lames sèches pendant au moins 3 semaines avant de les examiner. Gardez les glissières à plat pour réduire la possibilité de formation de bulles d’air.
4. Détermination de la densité de la colonne vertébrale dendritique
- Pour l’analyse de la densité de la colonne vertébrale dendritique dans les neurones pyramidaux de la région mPFC et CA1 de l’hippocampe, examiner les dendrites basales secondaires les plus latérales et les dendrites apicales tertiaires les plus latérales, comme décrit à l’étape 4.1.1 (Figure 2).
- Choisissez une dendrite, mesurez la longueur de la dendrite à l’aide d’un programme d’analyse d’image, comptez les épines sur les dendrites à l’aide d’un compteur manuel et enregistrez la longueur et le nombre d’épines.
- Étudiez et analysez six cellules par région (mPFC, CA1) par cerveau. Quantifiez un minimum de six cerveaux par groupe comme décrit précédemment 7,8. Choisissez des neurones qui répondent aux critères d’analyse suivants : les corps cellulaires et les dendrites sont bien imprégnés ; les dendrites se distinguent des cellules adjacentes et sont continues.
- Comptez les épines à 1000x (immersion dans l’huile) en comptant à la main avec un microscope optique et mesurez la longueur dendritique à l’aide d’un programme d’analyse d’images. Calculer la densité de la colonne vertébrale en divisant le nombre de la colonne vertébrale par la longueur de la dendrite et exprimer les données comme le nombre d’épines / 10 μm de dendrite.
REMARQUE: Il existe des méthodes beaucoup plus sophistiquées pour différencier les sous-types de colonne vertébrale et l’architecture dendritique qui peuvent être utilisées, mais le comptage manuel avec un microscope optique à 1000x peut donner un résultat rapide qui peut ensuite déterminer si une enquête plus approfondie est nécessaire. Bien que tous les efforts soient faits pour échantillonner systématiquement des dendrites similaires, il existe des variations d’épaisseur qui peuvent affecter le comptage.
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Representative Results
En utilisant la méthode rapide de Golgi, les cellules sont toujours bien imprégnées de sorte qu’il y a beaucoup de cellules à analyser. Il s’agit d’une nette amélioration par rapport aux méthodes précédentes où les expériences devaient être regroupées pour disposer de suffisamment de données pour l’analyse. Par conséquent, plus d’échantillons peuvent être traités à la fois et les cerveaux peuvent être conservés congelés jusqu’au traitement. Des exemples de cellules imprégnées de Golgi dans la région CA1 de l’hippocampe sont montrés à faible et haute puissance dans la figure 3. Le comptage des épines dans une région donnée donne des résultats cohérents avec de petites erreurs-types. Ceci est également important car on peut faire des comparaisons entre les expériences. La figure 4 illustre une expérience dans laquelle la densité basale de la colonne vertébrale dendritique a été augmentée sur des cellules pyramidales chez des rats adolescents mâles et femelles après enrichissement environnemental (EE) dans CA1 et le mPFC. Brièvement, les rats mâles et femelles ont été sevrés au jour postnatal (PND) 21 et assignés à des groupes témoins ou enrichis. Le groupe EE a passé 2 h/ jour dans un logement enrichi de PND 24-42 tandis que le groupe témoin a été logé dans des cages ordinaires pendant cette période. L’EE a induit, chez les adolescents des deux sexes, une augmentation de la densité basale de la colonne vertébrale dendritique dans le CA1 et le mPFC. Notez la petite erreur-type de la moyenne (MEB) dans toutes les valeurs de la colonne vertébrale dendritique.
Figure 1 : Surface ventrale du cerveau du rat. Photographie de la surface ventrale d’un cerveau de rat frais indiquant où couper en blocs antérieurs et postérieurs avant de les submerger dans des solutions initiales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Cellule pyramidale typique. Schéma d’une cellule pyramidale, illustrant les dendrites apicales et basales qui sont analysées pour la densité de la colonne vertébrale dendritique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Neurone imprégné de Golgi. Exemples de neurones imprégnés de Golgi dans la région CA1 de l’hippocampe du rat. À gauche : Plusieurs cellules pyramidales imprégnées. Barre d’échelle = 25 μm. En haut à droite : Dendrites basales. Barre d’échelle = 12,5 μm. En bas à droite : Exemple de dendrite basale secondaire. Les flèches désignent les épines. Barre d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Densité de la colonne vertébrale. Ensemble de données illustrant la densité basale et apicale de la colonne vertébrale dendritique dans la région mPFC et CA1 de l’hippocampe (CA1) après enrichissement environnemental (EE) par rapport au contrôle (CON) chez les rats mâles (M) et femelles (F). Les histogrammes montrent le nombre moyen d’épines/10 μm de dendrite + SEM. Les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique (voir Tableau des matériaux). Des ANOVA bidirectionnels (sexe X EE) ont été utilisés pour tester les différences entre les groupes et les tests de Fisher au LSD ont été utilisés pour l’analyse post-hoc. Les effets significatifs sont p<0.05. t indique une différence significative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le présent protocole décrit une méthode d’imprégnation de Golgi qui permet un traitement simultané rapide de nombreuses sections. Il s’agit d’une amélioration par rapport aux5 méthodes plus intensives en main-d’œuvre décrites précédemment et donne systématiquement des neurones imprégnés pour l’analyse. En outre, il y a moins d’exposition aux produits chimiques toxiques utilisés dans l’imprégnation de Golgi. La partie la plus difficile du processus consiste à faire en sorte que les sections soient plates sur les diapositives, ce qui nécessite une pratique considérable. Garder tout aussi froid que possible avec l’utilisation d’un spray de congélation est essentiel.
Une fois que les lames sont sèches et que l’analyse peut être effectuée, il est très important d’être cohérent dans la sélection des cellules qui sont comptées. Les cellules pyramidales de l’hippocampe sont choisies parmi CA1. Pour le mPFC, qui comporte plusieurs sous-parties, des cellules pyramidales du cortex infralimbique sont utilisées. Pour des raisons qui ne sont pas claires, moins de cellules dans le mPFC sont colorées que dans la région CA1 de l’hippocampe. De plus, il est possible de combiner des expériences lorsque toutes les sections ne peuvent pas être traitées ensemble pour des raisons logistiques. Par souci de cohérence, la même personne doit compter un ensemble donné de cellules.
Les limites de cette méthode sont similaires à toutes les méthodes d’imprégnation de Golgi. Le fait que seul un petit nombre de cellules soient colorées est un avantage. Le petit nombre de cellules imprégnées permet de visualiser l’ensemble de la cellule en trois dimensions. L’inconvénient de la méthode de Golgi est qu’il n’est pas clair quel sous-ensemble de cellules est étiqueté. Par conséquent, dans les expériences, il faut supposer que les cellules imprégnées pour les groupes témoins et expérimentaux sont les mêmes. Même si cette méthode entraîne une coloration bien meilleure que les méthodes précédentes, il y a toujours des cellules qui ne peuvent pas être analysées parce qu’elles sont recouvertes de débris, d’une bulle d’air ou ont des dendrites cassées.
En conclusion, la méthode rapide de Golgi décrite ici est une méthode rapide et sûre pour un marquage cohérent et reproductible des neurones qui peut être utilisé pour n’importe quelle région du cerveau. En plus de marquer les cellules du cortex préfrontal17,18 et de l’hippocampe 10,12,19, il a également été utilisé dans l’amygdale20, le cervelet 21 et le cortex22. En supposant que l’on soit familier avec l’anatomie et que l’on puisse identifier rapidement les cellules, le comptage manuel de la densité de la colonne vertébrale peut fournir un résultat rapide, mais il ne fournit pas d’informations sur les sous-types dendritiques, ce qui nécessite des méthodes d’analyse plus sophistiquées.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
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