Summary
이 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질에서 뉴런을 염색하기 위해 신경계의 모든 부분에 적응할 수있는 신속한 골지 방법의 변형을 기술합니다.
Abstract
골지 함침은 사소한 적응과 골지 염색 키트를 사용하여 쥐 해마와 내측 전두엽 피질에 수지상 척추를 함침시키는 데 사용됩니다. 이 기술은 사전 혼합 된 화학 물질이 사용하기에 더 안전하고, 뉴런이 일관되게 잘 함침되고, 배경 파편이 훨씬 적고, 주어진 영역에 대해 실험 사이에 척추 밀도의 편차가 극히 적기 때문에 골지 함침의 이전 방법에 비해 눈에 띄는 개선입니다. 또한, 뇌는 특정 시점 이후에 축적 될 수 있으며 추가 처리 될 때까지 얼어 붙을 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 관심있는 모든 뇌 영역을 연구 할 수 있습니다. 일단 염색되고 뚜껑이 미끄러지면, 수지상 척추 밀도는 덴드라이트 길이에 대한 척추의 수를 계산하여 결정되고 10 μm 덴드라이트 당 척추 밀도로 표현된다.
Introduction
뉴런을 표지하기 위해 칼륨 디크로메이트와 질산은을 사용하는 방법은 Camillo Golgi1,2에 의해 처음 기술되었으며, 이후 산티아고 라몬 y Cajal에 의해 뉴런과 아교 아형을 구별하는 엄청난 양의 작업을 생성하는 데 사용되었습니다. 그의 삽화와 함께 최근에 출판 된 책을 지금 사용할 수 있습니다3. 100여 년 전에 출판된 라몬 이 카잘(Ramon y Cajal)의 연구에 따르면, 골지 함침은 거의 사용되지 않았다. 골지 함침은 광학 현미경으로 뉴런의 입체 시각화를 가능하게하는 힘든 과정입니다. 수년에 걸쳐 골지 방법의 수많은 변형이 있었고, 그 방법이 더 쉽고 염색이 더 일관되게 이루어지도록4. 1984년, Gabbott과 Somogyi5는 보다 신속한 처리를 가능하게 하는 단일 섹션 골지 함침 절차를 기술했다. 이 골지 함침 방법은 4 % 파라 포름 알데히드와 1.5 % 피크르산으로 관류해야하며, 고정 후 3 % 칼륨 디크로메이트의 욕조로 비브라 톰을 절편해야합니다. 섹션은 유리 슬라이드에 장착되며, 커버 슬립의 네 모서리는 질산은에 담그면 확산이 점진적으로 진행되도록 접착됩니다. 그런 다음 커버 슬립이 튀어 나오고 섹션이 탈수되고 결국 장착 매체로 영구적으로 미끄러 져 덮습니다. 이 기술은 해마에서 뉴런과 글리아 6,7,8을 라벨링하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 여기에 설명 된 신속한 골지 방법은 칼륨 디크로메이트와 질산은 모두에 대한 노출이 훨씬 적고 파라포름 알데히드와 피크르산이 사용되지 않기 때문에 개선되었습니다. 또한, Gabbott 및 Somogyi5 방법의 변형을 사용하여 함침시킨 세포를 분석 할 수 있었지만, 종종 탈수 단계 동안 섹션이 과다 또는 과소 노출되거나 슬라이드에서 떨어졌으며 일반적으로 분석을 위해 충분한 세포를 갖도록 여러 실험을 풀링해야했습니다.
본 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질 (mPFC)에서 수지상 및 수지상 척추를 표지하기 위해 골지 염색 키트 (물질의 표 참조)의 사용을 기술한다. 이전 방법보다이 방법의 장점은 빠르고, 연구원에게 유해한 화학 물질에 덜 노출되며 뉴런의 일관된 염색이 있다는 것입니다. 아래에 기술된 프로토콜은 많은 연구에서 래트의 해마 및 mPFC에서 수지상 척추 밀도를 평가하기 위해 사소한 변형과 함께 사용되어 왔으며 많은 연구 9,10,11,12,13,14,15에서 사용되었다.
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Protocol
모든 실험 절차는 Sacred Heart University Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 NIH Guide for the Care and Use of Animals에 따릅니다.
1. 뇌 조직의 분리 및 침윤
- 골지 염색 키트의 용액 A 및 B를 24시간 전에 프리믹스하고 어두운 병 및/또는 어둠 속에 보관한다. 약 80mL의 용액 A와 B를 섞어 24시간 후에 용액을 바꾸기에 충분하게 만든다. 밀폐 된 병에 보관하십시오.
참고 : 식염수 또는 파라 포름 알데히드와의 관류는 필요하지 않습니다. - 이산화탄소 안락사 후 단두대에 의해 쥐를 희생시키고 몇 초 안에 뇌를 제거하십시오. 필요한 경우 식염수로 뇌를 헹구지 만 반드시 필요한 것은 아닙니다.
- 뇌, 피질을 아래로 내려 놓으면 시상 하부가 보이지 않게되는데, 그 이유는 상처가 비다공성 표면에 전방과 후방으로 만들어지기 때문입니다. 그림 1과 같이 전방 (전두엽 피질 포함) 및 후부 (해마 포함) 블록으로 자릅니다.
- 블록을 A와 B의 사전 혼합 용액에 넣고 용액에 잘 잠겨 있는지 확인하십시오. 용액 A와 B의 부피가 블록을 담그기에 충분한지 확인하십시오. 실온에서 어둠 속에서 갈색 병 또는 호일로 덮인 투명한 병 (빛을 유지하기 위해)에 블록을 보관하십시오.
- 24 시간 후에 용액을 교체하고 실온에서 또 다른 13 일 동안 어둠 속에서 유지하십시오.
참고 : 마우스 두뇌와 함께 사용하면 차단할 필요가 없으며 전체 뇌를 솔루션에 배치 할 수 있습니다. 크기가 다른 뇌 영역을 염색하는 경우, 용액 A와 B의 시간은 시행 착오에 의해 결정되어야 할 수도 있습니다. - 2주 후 조직은 용액 A 및 B로 잘 침윤되고, 블록을 동결보호제 용액(골지 염색 키트의 용액 C)으로 옮기고, 4°C에서 48-72시간 동안 방치한다.
참고: 냉동 보호 후 추가 처리까지 블록이 동결될 수 있습니다. 또한 키트의 모든 솔루션은 수집되어 유해 폐기물로 처리됩니다. - 드라이 아이스 위의 유리 슬라이드에서 뇌, 피질을 아래로 얼립니다. 일단 냉동 냉동 또는 냉동 스탯을 사용하여 절편화될 때까지 -80°C에서 저장한다.
참고 : 액체 질소에서 동결하면 조직에 균열이 생기지 마십시오.
2. 뇌 조직의 단면화
- 소량의 조직 배지를 미리 냉각된 냉동 척 위에 놓습니다. 블록의 한쪽면을 손으로 약간 해동(gloved)하고 조직 배지 위에 놓음으로써 cryostat 척에 블록을 장착하십시오.
참고 : 조직을 포함 할 필요는 없습니다. 해마를 포함하는 블록은 후자가 코퍼스 캘로섬에 앞쪽이고 두 개의 반쪽이 분리되어 있기 때문에 전두엽 피질이있는 블록보다 절단하기가 다소 쉽습니다. - -22°C에서 냉동 상태에서 100μm 절편을 절단하고 서브베드 슬라이드에 장착합니다. 최대 150μm 두께의 절편을 사용할 수 있습니다. 슬라이드당 3-4개의 코로나 섹션을 마운트하면 처리가 필요한 슬라이드 수가 줄어들어 보십시오. 다음 기술 중 하나를 사용하여 섹션이 슬라이드에 올라갈 때까지 고정된 상태로 유지합니다.
참고: 이 섹션은 일반적인 방법으로 고정되어 있지 않으므로 빠르게 녹는 경향이 있습니다. 슬라이드에서 섹션이 녹을 수 있도록 합니다. 슬라이드에 놓이기 전에 녹기 시작하면 슬라이드에서 평평하게 만들 수 없습니다. 이 작업을 수행하는 몇 가지 기술이 있습니다.- 나이프와 블록에 냉동 스프레이를 사용하십시오. 실내의 온도와 습도에 따라 모든 섹션에 필요할 수 있습니다. 안티롤 플레이트 또는 브러시를 사용하여 절단하는 동안 섹션을 평평하게 유지하십시오.
참고 : 냉동 스프레이가 충분한지 확인하십시오. 20 블록을 절단 할 때 여러 캔을 사용할 수 있습니다. - 가능한 경우 실온 슬라이드를 사용하여 해동 장착하고 신속하게 섹션에 놓습니다. 연습을 통해 한 번에 여러 섹션을 마운트 할 수 있습니다. 그래도 작동하지 않으면 슬라이드를 냉동 장치에 보관하여 매우 차갑게하고 차가운 포셉이나 차가운 페인트 브러시로 섹션을 옮긴 다음 마운트를 해동하십시오.
- 나이프와 블록에 냉동 스프레이를 사용하십시오. 실내의 온도와 습도에 따라 모든 섹션에 필요할 수 있습니다. 안티롤 플레이트 또는 브러시를 사용하여 절단하는 동안 섹션을 평평하게 유지하십시오.
- 조각 사이에 종이 물티슈로 나이프를 닦으십시오. 칼에 더 많은 청소가 필요한 경우 100 % 에탄올 (EtOH)을 사용하고 다음 조각을 자르기 전에 말리십시오.
- 슬라이드에 장착한 후 슬라이드를 골판지 슬라이드 트레이에 평평하게 놓고 어두운 곳에서 실온(몇 시간에서 최대 48시간 동안)에서 섹션을 건조시킵니다. 슬라이드 트레이를 덮지 마십시오. 골지 함침 전에 섹션이 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 골지가 함침 될 때까지 슬라이드 트레이에 평평하게 보관하십시오.
참고: 섹션을 건조해도 손상되지 않습니다.
3. 뇌 조직의 염색 및 탈수
- 유리 스테인드 요리에서 스테인팅을 수행하십시오. 염색 직전에 용액 D와 E를 혼합하십시오. 프로토콜에 따라 용액 D의 한 부분, 용액 E의 한 부분 및 증류수의 두 부분을 추가하십시오. 유리 스테인팅 접시의 경우, 200 mL 용액을 만들어 섹션을 완전히 잠급니다. Koplin 항아리의 경우, 이것은 더 적은 양을 필요로합니다.
- 슬라이드를 섹션에 대한 솔루션 액세스를 허용하기에 충분히 멀리 떨어진 랙에 배치합니다.
- 절편을 4분(2x) 동안 증류수에 넣고, 이를 골지 함침 염색 용액에 넣고 10분 동안 넣는다. 염색 용액을 70 섹션마다 변경하십시오. 증류수가 노랗게 변하면 바꿉니다.
참고: 염색 단계의 타이밍은 매우 중요합니다. 너무 짧으면 염색이 충분하지 않고 염색이 너무 길어서 분석을 수행 할 때 수상 돌기를 분리하기가 어렵습니다. 일단 염색 용액에서 벗어나면 타이밍이 덜 중요합니다. - 절편을 다음과 같이 탈수시킨다: 70% EtOH (5분), 95% EtOH (5분; 2x), 100% EtOH (5분; 2x), 클리어링제 (5분; 3x). 모든 솔루션, 특히 100 % EtOH 및 클리어링 에이전트를 자주 변경하여 섹션이 무수 상태로 유지되도록하십시오.
참고: 50% EtOH 단계를 거칠 필요는 없습니다. 골지 함침이 충분한 대조를 제공하기 때문에 세포 시각화에 역염색이 필요하지 않습니다. 다른 청산 요원의 사용은 여기에 사용 된 것과 마찬가지로 작동하지 않았습니다 ( 자료 표 참조). - 길이 60mm의 유리 커버슬립이 달린 커버슬립과 넉넉한 양의 장착 매체가 장착되어 있습니다. 가능한 한 적은 수의 기포가 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 다시 실행하십시오 (몇 주 후에 수행 할 수 있음). 섹션을 손상시키지 않기 위해이 작업을 매우 천천히 수행하십시오 (많은 양의 장착 매체로 인해 수행 할 수 있음).
참고: 많은 양의 장착 매체는 다소 지저분하지만 두꺼운 100μm 섹션을 덮기 위해 충분한 장착 매체를 사용해야 하기 때문에 여전히 필요합니다. - 단면에 커버슬립을 하나만 놓으려면 프로세스 전에 커버슬립을 분리하십시오.
- 덮개가 미끄러지면 마른 슬라이드가 3-5 일 동안 비 다공성 종이에 평평하게 미끄러 져 특히 첫날 이후에 약간 움직여 달라 붙지 않도록하십시오. 3-5 일 후에 슬라이드를 슬라이드 홀더로 옮기고, 이상적으로는 슬라이드를 검사하기 전에 적어도 3 주 동안 슬라이드를 건식시킵니다. 기포가 형성될 가능성을 줄이기 위해 슬라이드를 평평하게 유지하십시오.
4. 수지상 척추 밀도의 결정
- 해마의 mPFC 및 CA1 영역 둘 다의 피라미드형 뉴런에서의 수지상 척추 밀도의 분석을 위해, 단계 4.1.1에 기술된 바와 같이 가장 측방적인 2차 기저 수상 돌기와 가장 측방 3차 정점 수상돌기를 검사한다(도 2).
- 덴드라이트를 선택하고, 이미지 분석 프로그램을 사용하여 수상 돌기의 길이를 측정하고, 핸드 카운터를 사용하여 수상 돌기의 척추를 계산하고, 척추의 길이와 수를 모두 기록합니다.
- 뇌 당 영역 당 여섯 세포 (mPFC, CA1)를 연구하고 분석하십시오. 앞서 설명한 바와 같이 그룹당 최소 6개의 뇌를 정량화한다(7,8). 분석을위한 다음 기준을 충족하는 뉴런을 선택하십시오 : 세포체와 수상 돌기가 잘 함침되어 있습니다. 수상 돌기는 인접한 세포와 구별 할 수 있으며 연속적입니다.
- 광 현미경으로 손으로 계산하여 1000x (오일 침지)로 척추를 계산하고 이미지 분석 프로그램을 사용하여 수지상 길이를 측정하십시오. 척추 수를 수상 돌기의 길이로 나눠서 척추 밀도를 계산하고 데이터를 척추 수 / 10 μm 덴드라이트로 표현하십시오.
참고 : 척추 아형과 수지상 구조를 구별하기위한 훨씬 더 정교한 방법을 사용할 수 있지만 1000x의 광 현미경으로 손으로 계산하면 추가 조사가 필요한지 여부를 결정할 수있는 빠른 결과를 얻을 수 있습니다. 유사한 덴드라이트를 일관되게 샘플링하기 위해 모든 노력을 기울 였지만 계수에 영향을 줄 수있는 두께의 변화가 있습니다.
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Representative Results
신속한 골지 방법을 사용하면 세포가 지속적으로 잘 함침되어 분석 할 세포가 많이 있습니다. 이는 분석을 위해 충분한 데이터를 확보하기 위해 실험을 풀링해야 했던 이전 방법에 비해 눈에 띄는 개선입니다. 따라서 한 번에 더 많은 샘플을 처리 할 수 있으며 처리 될 때까지 뇌를 냉동 보관할 수 있습니다. 해마의 CA1 영역에 골지 함침된 세포의 예는 도 3에 저전력과 고출력으로 도시되어 있다. 주어진 영역에서 척추를 세면 작은 표준 오류로 일관된 결과를 얻을 수 있습니다. 이것은 또한 실험 간의 비교를 할 수 있기 때문에 중요합니다. 도 4 는 CA1 및 mPFC 둘 다에서 환경 농축 (EE) 후 사춘기 수컷 및 암컷 래트에서 피라미드 세포 상에서 기저 수지상 척추 밀도가 증가되는 실험을 도시한다. 간략하게, 수컷 및 암컷 래트를 산후 날(PND)(21)에 이유식시키고, 대조군 또는 농축된 그룹에 배정하였다. EE 그룹은 PND 24-42의 농축 주택에서 하루 2 시간을 보냈고 대조군은이 기간 동안 일반 케이지에 보관되었습니다. EE는 남녀 모두의 청소년에서 CA1과 mPFC 모두에서 기저 수지상 척추 밀도의 증가를 유도했습니다. 모든 수지상 척추 값에서 평균 (SEM)의 작은 표준 오차를 주목하십시오.
그림 1 : 쥐 뇌의 복부 표면. 블록을 초기 용액으로 잠수하기 전에 전방 및 후방 블록으로 절단 할 위치를 나타내는 신선한 쥐 뇌의 복부 표면 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 일반적인 피라미드형 셀. 피라미드 세포의 도식, 수지상 척추 밀도에 대해 분석되는 정점 및 기저 수상 돌기를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 골지 함침 뉴런. 골지 함침 뉴런의 예는 래트 해마의 CA1 영역에 함침시켰다. 왼쪽: 여러 개의 함침된 피라미드 세포. 스케일 바 = 25 μm. 오른쪽 위: 기저 덴드라이트. 스케일 바 = 12.5 μm. 오른쪽 아래: 보조 기저 덴드라이트의 예. 화살표는 척추를 나타냅니다. 배율 막대 = 5μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 척추 밀도. 수컷 (M) 및 암컷 래트 (F)에서 대조군 (CON)과 비교하여 환경 농축 (EE)에 뒤따르는 해마 (CA1)의 mPFC 및 CA1 영역에서의 기저 및 정점 수지상 척추 밀도를 나타내는 데이터 세트. 히스토그램은 평균 척추 수/10μm 수상 돌기 + SEM을 보여줍니다. 데이터는 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다( 물질 표 참조). 양방향 (섹스 X EE) ANOVA를 사용하여 그룹 차이를 테스트하고 피셔의 LSD 테스트를 사후 분석에 사용했습니다. 중요한 효과는 p<0.05입니다. t는 유의한 차이를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 프로토콜은 많은 섹션들의 신속한 동시 처리를 가능하게 하는 골지 함침의 방법을 기술한다. 이전에 설명한5 가지 노동 집약적 인 방법에 비해 개선되었으며 분석을 위해 함침 된 뉴런을 지속적으로 산출합니다. 또한, 골지 함침에 사용되는 독성 화학 물질에 대한 노출이 적습니다. 이 과정에서 가장 어려운 부분은 슬라이드에서 섹션을 평평하게 만드는 것이므로 상당한 연습이 필요합니다. 냉동 스프레이를 사용하여 모든 것을 가능한 한 차갑게 유지하는 것이 필수적입니다.
슬라이드가 건조되고 분석이 수행되면 계수되는 세포를 일관되게 선택하는 것이 매우 중요합니다. 해마 피라미드 세포는 CA1로부터 선택된다. 여러 하위 부분이있는 mPFC의 경우 적외선 피질의 피라미드 세포가 사용됩니다. 명확하지 않은 이유로, mPFC 내의 더 적은 세포가 해마의 CA1 영역에서보다 염색된다. 또한 물류상의 이유로 모든 섹션을 함께 처리 할 수없는 경우 실험을 결합 할 수 있습니다. 일관성을 위해 동일한 사람이 주어진 셀 집합을 계산해야합니다.
이 방법의 한계는 모든 골지 함침 방법과 유사합니다. 소수의 세포 만 염색된다는 사실은 장점입니다. 함침된 세포의 수가 적으면 전체 세포를 세 차원으로 시각화할 수 있습니다. 골지 방법의 단점은 세포의 어떤 하위 집합이 라벨링되어 있는지 명확하지 않다는 것입니다. 따라서 실험에서는 대조군과 실험군 모두에 함침된 세포가 동일하다고 가정해야 한다. 이 방법으로 인해 이전 방법보다 훨씬 더 나은 염색이 발생하더라도 파편, 기포 또는 덴드라이트로 덮여 있기 때문에 분석 할 수없는 세포가 항상 있습니다.
결론적으로, 여기에 설명 된 신속한 골지 방법은 모든 뇌 영역에 사용할 수있는 뉴런의 일관되고 재현 가능한 표지를위한 빠르고 안전한 방법입니다. 전두엽 피질17,18 및 해마 10,12,19에서 세포를 표지하는 것 외에도, 편도체20, 소뇌21 및 피질22에도 사용되었습니다. 해부학에 익숙하고 세포를 신속하게 식별 할 수 있다고 가정하면 척추 밀도의 손 계수는 빠른 결과를 제공 할 수 있지만 더 정교한 분석 방법이 필요한 수지상 아형에 대한 정보는 제공하지 않습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
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