טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים
Summary
הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים באמצעות חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו מתאים בתנאים מחמירים של אי-דנטורציה ודנאטורציה.
Abstract
Ubiquitination הוא סוג של שינוי posttranslational המסדיר לא רק את היציבות אלא גם את לוקליזציה ותפקוד של חלבון המצע. תהליך ה-ubiquitination מתרחש באופן תוך-תאי באאוקריוטים ומווסת כמעט את כל התהליכים הביולוגיים הבסיסיים של התאים. טיהור של חלבונים ubiquitinated מסייע לחקור את התפקיד של ubiquitination בשליטה על תפקוד של חלבונים המצע. כאן, הליך שלב אחר שלב לטיהור חלבונים ubiquitinated בתאי יונקים מתואר עם חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו בתנאים מחמירים של אי-דנטורינג ודנאטורציה. סה”כ חלבון p53 המתויג כ-Flag טוהר באמצעות אגרוז מצומד נגד נוגדנים של פלאג בתנאים של אי-דנטורציה. לחלופין, סך כל החלבון התאי המתויג כיוביקוויטין טוהר באמצעות שרף טעון ניקל בתנאי דנטורציה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום באלואטים זוהו בהצלחה עם נוגדנים ספציפיים. באמצעות הליך זה, ניתן לטהר ביעילות את הצורות הנמצאות בכל מקום של חלבון נתון מתאי יונקים, ובכך להקל על מחקרים על התפקידים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד החלבון.
Introduction
אוביקוויטין הוא חלבון משומר אבולוציונית של 76 חומצות אמינו 1,2,3. אוביקוויטין קושר באופן קוולנטי שאריות ליזין על חלבוני מטרה באמצעות מפלים המערבים אנזימים מפעילים (E1), מצומדים (E2) וליגאז (E3). יוביקוויטין מופעל תחילה על ידי האנזים E1 ולאחר מכן מועבר לאנזימים המצומדים E2. לאחר מכן, ליגאזות יוביקוויטין E3 מתקשרות הן עם אנזימי E2 טעונים ביוביקוויטין והן עם חלבוני סובסטרט ומתווכות את היווצרותו של קשר איזופפטידי בין מסוף C של יוביקוויטין לבין שאריות ליזין במצע 1,2,3,4,5. יוביקוויטינציה כרוכה בחיבור של יוביקוויטין מואטי לשאריות ליזין על חלבוני המצע או לעצמה, מה שמוביל למונוביקוויטינציה של חלבונים או לפוליוביקוויטינציה. תהליך זה של ubiquitination מתרחש באופן תוך-תאי באאוקריוטים ומסדיר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. יוביקוויטינציה גורמת לפירוק חלבוני הסובסטרט באמצעות מערכת יוביקוויטין-פרוטאזומים 1,2,3,4,5. בנוסף, יוביקוויטינציה מווסתת לוקליזציה של חלבונים תת-תאיים, היווצרות קומפלקס חלבונים וסחר בחלבונים בתאים 3,5. ניתן להסיר יוביקוויטין מואטי הקשור לחלבוני סובסטרט על ידי דה-אוביקוויטין אנזימים (DUBs)6,7. יש לציין כי הדרכים השונות שבהן שרשראות יוביקוויטין מורכבות מספקות מספר עצום של אמצעים לוויסות תהליכים ביולוגיים שונים 1,5. התפקידים המדויקים של יוביקוויטינציה בוויסות תפקוד חלבון המצע עדיין אינם מובנים במלואם עד כה. הטיהור של חלבונים ubiquitinated תורם להבהרת ההשפעות של חלבון ubiquitination על מגוון רחב של תהליכים תאיים.
החלבון p53 הוא אחד החלבונים מדכאי הגידול החשובים ביותר והוא מציג מוטציות גנטיות או השבתה כמעט בכל סוגי הסרטן האנושיים 8,9,10,11. היציבות והפעילות של P53 מווסתות בעדינות in vivo על-ידי שינויים פוסט-טרנסלציוניים, כולל יוביקוויטינציה, זרחון, אצטילציה ומתילציה12,13. לחלבון p53 יש זמן מחצית חיים קצר הנע בין 6 דקות ל-40 דקות בתאים שונים, מה שנובע בעיקר מהפוליוביקוויטינציה שלו ומפירוק פרוטאזומלי10,12 לאחר מכן. עכבר כפול דקה 2 (Mdm2) הוא ליגאז יוביקוויטין E3 של p53 הנקשר ל-N-terminus של p53 כדי לעכב את פעילות השעתוק שלו12,14,15. Mdm2 מקדם את הפוליוביקוויטינציה והפירוק הפרוטיאזומלי של p53 כדי לשלוט ביציבותו וגורם למונוביקוויטינציה של p53 כדי להקל על ייצוא הגרעין שלה12,14,15,16. כאן, יוביקוויטינציה p53 בתיווך Mdm2 משמשת כדוגמה להצגת שיטה לטיהור חלבונים יוביקוויטין מתאי יונקים בפירוט. ניתן לזהות את הרגולטורים המשפיעים על מצב האוביקוויטינציה של חלבוני המטרה באמצעות בדיקת יוביקוויטינציה in vivo זו כאשר הם מתבטאים יתר על המידה או מופלים/נדפקים בתאי יונקים. בנוסף, חלבונים המכילים יוביקוויטין יכולים לשמש כמצעים לבדיקת דאוביקוויטינציה במבחנה. ניתן לבצע בדיקת תפוקה גבוהה כדי לזהות DUBs ספציפיים עבור חלבוני מטרה על ידי דגירה של מצעים ubiquitinated עם DUBs בודדים. חלבונים הנמצאים בכל מקום עשויים לשמש כפיגום לגיוס חלבוני איתות במורד הזרם בתאים. קומפלקס חלבוני מטרה הנמצאים בכל מקום יכול להיות מטוהר על ידי מיצוי חיסוני רציף בתנאי טיהור מקומיים ולזהות על ידי ספקטרומטריית מסה. ניתן להשתמש בפרוטוקול הנוכחי באופן נרחב כדי לחקור את החלבונים התאיים המווסתים על ידי יוביקוויטינציה.
מספר שיטות הוקמו כדי לטהר חלבונים ubiquitinated, הכוללות שימוש ביוביקוויטין המתויג על ידי זיקה, נוגדני יוביקוויטין, חלבונים קושרי יוביקוויטין, ותחומים מבודדים הקושרים יוביקוויטין (UBDs)17. כאן, אנו מספקים פרוטוקול המשתמש ביוביקוויטין המתויג כמתווך לטיהור חלבונים הנמצאים בתאים של יונקים. השימוש ביוביקוויטין המתויג של פולי-היס מציע יתרונות על פני השיטות האחרות. חלבונים הנמצאים בכל מקום מטוהרים בנוכחות דנטורנטים חזקים, מה שמפחית קשירה לא ספציפית לשרף טעון ניקל על ידי ליניאריזציה של חלבונים תאיים ושיבוש אינטראקציות חלבון-חלבון. לעומת זאת, השימוש בנוגדנים ליוביקוויטין, חלבונים קושרי יוביקוויטין ו-UBDs מבודדים כמתווכים אינו יכול להוציא ביעילות שותפים קושרים מחלבון המטרה מכיוון שיש לבצע טיהור בתנאים פחות מחמירים. יתר על כן, טיהור עשוי גם להוביל לקשירה מוגברת של חלבונים שאינם קשורים באמצעות מתווכים אלה. בנוסף, קיימת נטייה מחייבת לסוגי קישור שונים של יוביקוויטין, כמו גם מונו ופולי-יוביקוויטינציה על ידי חלבונים קושרי יוביקוויטין או UBDs17 מבודדים. השימוש באוביקוויטין המתויג על-ידי פולי-היס תורם להורדת כל החלבונים הנמצאים בכל התאים הנמצאים בכל מקום. לחלופין, השימוש באגרוז מצומד נגד פלאג או אנטי-HA זמין מסחרית ומקל על חיסונית חלבוני מטרה מתויגים של דגל או HA בקנה מידה גדול בתנאים שאינם מתויגים. שלב טיהור שני, לדוגמה, על ידי שרף טעון ניקל המכוון ליוביקוויטין מתויג פולי-היס, יכול לשמש לרכישת חלבוני מטרה ubiquitinated עם טוהר גבוה לניסויים במורד הזרם. יש לציין כי אסטרטגיית טיהור תיוג אפיטופים יכולה להיות מותאמת כאשר לא ניתן לרכוש נוגדן מסוים לחלבוני מטרה חיסוניים יעילים. לבסוף, טיהור של חלבונים ubiquitinated בתאי יונקים, בהשוואה לטיהור במבחנה, שומר על מצב הקישור של יוביקוויטין של חלבוני מטרה בתנאים פיזיולוגיים יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
יוביקוויטינציה ממלאת תפקיד קריטי כמעט בכל התהליכים התאיים הפיזיולוגיים והפתולוגיים2. בשנים האחרונות חלה התקדמות רבה בהבנת התפקיד המולקולרי של יוביקוויטין במסלולי איתות וכיצד שינויים במערכת האוביקוויטין מובילים למחלות אנושיות שונות2. הטיהור של חלבונים המכילי?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81972624) לד.ל.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
References
- Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
- Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains – from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
- Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
- Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
- Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
- Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
- Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
- Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
- Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
- Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
- Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
- Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
- Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
- Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
- Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
- Green, M., Sambrook, J. . Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, 28 (2012).
