Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

Summary

El protocolo describe un método paso a paso para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos utilizando la proteína supresora de tumores p53 como ejemplo. Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron de células bajo estrictas condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes.

Abstract

La ubiquitinación es un tipo de modificación postraduccional que regula no solo la estabilidad sino también la localización y función de una proteína sustrato. El proceso de ubiquitinación ocurre intracelularmente en eucariotas y regula casi todos los procesos biológicos celulares básicos. La purificación de proteínas ubiquitinadas ayuda a la investigación del papel de la ubiquitinación en el control de la función de las proteínas de sustrato. Aquí, se describe un procedimiento paso a paso para purificar proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos con la proteína supresora de tumores p53 como ejemplo. Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron bajo estrictas condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes. La proteína p53 marcada con Flag celular total se purificó con agarosa conjugada con anticuerpos anti-Flag en condiciones no desnaturalizantes. Alternativamente, la proteína ubiquitinada marcada con His celular total se purificó utilizando resina cargada de níquel en condiciones de desnaturalización. Las proteínas p53 ubiquitinadas en los eluidos se detectaron con éxito con anticuerpos específicos. Usando este procedimiento, las formas ubiquitinadas de una proteína dada pueden purificarse eficientemente a partir de células de mamíferos, facilitando estudios sobre el papel de la ubiquitinación en la regulación de la función de las proteínas.

Introduction

La ubiquitina es una proteína evolutivamente conservada de 76 aminoácidos ^1,2,3. La ubiquitina se une covalentemente a los residuos de lisina en las proteínas diana a través de cascadas que involucran enzimas activadoras (E1), conjugadas (E2) y ligasas (E3). La ubiquitina es activada primero por la enzima E1 y luego se transfiere a las enzimas conjugadoras E2. Posteriormente, las ligasas de ubiquitina E3 interactúan tanto con las enzimas E2 cargadas de ubiquitina como con las proteínas de sustrato y median la formación de un enlace isopeptídico entre el C-terminal de ubiquitina y un residuo de lisina en el sustrato 1,2,3,4,5. La ubiquitinación implica la unión de restos de ubiquitina a residuos de lisina en proteínas de sustrato o a sí misma, lo que lleva a la monoubiquitinación de proteínas o poliubiquitinación. Este proceso de ubiquitinación ocurre intracelularmente en eucariotas y regula una gran variedad de procesos biológicos. La ubiquitinación resulta en la degradación de proteínas sustrato a través del sistema ubiquitina-proteasoma 1,2,3,4,5. Además, la ubiquitinación modula la localización subcelular de proteínas, la formación de complejos proteicos y el tráfico de proteínas en las células ^3,5. Las fracciones de ubiquitina ligadas a proteínas sustrato pueden ser eliminadas por enzimas desubiquitinantes (DUB)^6,7. En particular, las diferentes formas en que se ensamblan las cadenas de ubiquitina proporcionan una miríada de medios para regular diversos procesos biológicos ^1,5. Los roles exactos de la ubiquitinación en la regulación de la función de la proteína sustrato siguen sin entenderse completamente hasta ahora. La purificación de proteínas ubiquitinadas contribuye a la elucidación de los efectos de la ubiquitinación de proteínas en una variedad de procesos celulares.

La proteína p53 es una de las proteínas supresoras de tumores más importantes y exhibe mutaciones genéticas o inactivación en casi todos los cánceres humanos 8,9,10,11. La estabilidad y la actividad de p53 están delicadamente reguladas in vivo mediante modificaciones postraduccionales, incluyendo ubiquitinación, fosforilación, acetilación y metilación^12,13. La proteína p53 tiene una vida media corta que varía de 6 min a 40 min en varias células, lo que resulta principalmente de su poliubiquitinación y posterior degradación proteasómica^10,12. El ratón doble minuto 2 (Mdm2) es una ubiquitina ligasa E3 de p53 que se une al N-terminal de p53 para inhibir su actividad transcripcional^12,14,15. Mdm2 promueve la poliubiquitinación y degradación proteasómica de p53 para controlar su estabilidad e induce la monoubiquitinación de p53 para facilitar su exportación nuclear^12,14,15,16. Aquí, la ubiquitinación de p53 mediada por Mdm2 se utiliza como ejemplo para introducir un método para la purificación de proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos en detalle. Los reguladores que influyen en el estado de ubiquitinación de las proteínas diana se pueden identificar utilizando este ensayo de ubiquitinación in vivo cuando se sobreexpresan o se derriban / eliminan en células de mamíferos. Además, las proteínas ubiquitinadas se pueden utilizar como sustratos para el ensayo de desubiquitinación in vitro. Se puede realizar un cribado de alto rendimiento para identificar DUB específicos para proteínas diana mediante la incubación de sustratos ubiquitinados con DUB individuales. Las proteínas ubiquitinadas pueden actuar como un andamio para reclutar proteínas de señalización aguas abajo en las células. Un complejo de proteína diana ubiquitinado puede purificarse mediante inmunoprecipitación secuencial en condiciones de purificación nativas e identificarse mediante espectrometría de masas. El protocolo actual se puede utilizar ampliamente para investigar las proteínas celulares reguladas por ubiquitinación.

Se han establecido varios métodos para purificar proteínas ubiquitinadas, que incluyen el uso de ubiquitina marcada por afinidad, anticuerpos de ubiquitina, proteínas de unión a ubiquitina y dominios aislados de unión a ubiquitina (UBD)¹⁷. Aquí, proporcionamos un protocolo que utiliza ubiquitina marcada con afinidad como mediador para purificar proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos. El uso de ubiquitina poli-marcada con His ofrece ventajas sobre los otros métodos. Las proteínas ubiquitinadas se purifican en presencia de desnaturalizantes fuertes, lo que reduce la unión no específica a la resina cargada de níquel mediante la linealización de proteínas celulares y la interrupción de las interacciones proteína-proteína. Por el contrario, el uso de anticuerpos contra la ubiquitina, proteínas de unión a ubiquitina y UBD aisladas como mediadores no puede excluir eficazmente a los socios de unión de la proteína diana porque la purificación debe realizarse en condiciones menos estrictas. Además, la purificación también puede conducir a una mayor unión de proteínas no relacionadas utilizando estos mediadores. Además, existe una propensión a la unión a varios tipos de enlaces de ubiquitina, así como a la mono y poliubiquitinación por proteínas de unión a ubiquitina o UBD aisladas¹⁷. El uso de ubiquitina poli-marcada con His contribuye a derribar todas las proteínas ubiquitinizadas celulares. Alternativamente, el uso de agarosa conjugada con anticuerpos anti-Flag o anti-HA disponibles comercialmente facilita la inmunoprecipitación de proteínas diana marcadas con Flag o HA a gran escala en condiciones no desnaturalizantes. Un segundo paso de purificación, por ejemplo, mediante resina cargada de níquel dirigida a ubiquitina poli-marcada con His, se puede utilizar para adquirir proteínas diana ubiquitinadas con una alta pureza para experimentos posteriores. En particular, una estrategia de purificación de marcado de epítopos se puede adaptar cuando no se puede adquirir un anticuerpo específico para inmunoprecipitar proteínas diana de manera efectiva. Finalmente, la purificación de proteínas ubiquitinadas en células de mamíferos, en comparación con la purificación in vitro, conserva el modo de enlace de ubiquitina de las proteínas diana en condiciones más fisiológicas.

Protocol

NOTA: Las células H1299 fueron amablemente proporcionadas por el Banco de Células Madre de la Academia China de Ciencias y se demostró que eran negativas para la contaminación por micoplasma. 1. Cultivo celular Para el cultivo inicial, colocar 1 x 106 células de la línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano, H1299 en una placa de Petri de 10 cm con 10-12 ml de RPMI 1640 medio suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de aditivo de g…

Representative Results

El diagrama esquemático muestra las proteínas p53 (Flag-p53) y ubiquitina doble marcada con His/HA (HH-Ub) (Figura 1A). Los procedimientos utilizados para purificar las proteínas ubiquitinadas se resumen en la Figura 1B. La ubiquitina marcada con Poly-His se puede ligar a proteínas diana en células de mamíferos. Las proteínas ubiquitinadas pueden purificarse con perlas Flag/M2 en condiciones no desnaturalizantes o mediante cromatografía de afinidad ióni…

Discussion

La ubiquitinación juega un papel crítico en casi todos los procesos celulares fisiológicos y patológicos². En los últimos años, se ha avanzado mucho en la comprensión del papel molecular de la ubiquitina en las vías de señalización y cómo los cambios en el sistema de ubiquitina conducen a diferentes enfermedades humanas². La purificación de proteínas ubiquitinadas contribuye a proporcionar información sobre los roles exactos de ubiquitinación en estos proceso…

Materials

β-mercaptoethanol	Sangon Biotech	M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)	GE healthcare	NA931	Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)	GE healthcare	NA935	Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220	FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody	Santa cruz	sc-9996	Primary antibody
Anti-HA High Affinity	Roche	11867423001	Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14)	Santa cruz	sc-965	Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1)	Santa cruz	sc-126	Primary antibody
EDTA	Sigma-Alddich	E5134	solvent
Fetal Bovine Serum	VivaCell	C04001-500	FBS
FLAG Peptide	Sigma-Alddich	F3290	Prepare elution buffer
GlutaMAX	Gibco	35050-061	supplement
Guanidine-HCI	Sangon Biotech	A100287-0500	solvent
H1299	Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab	Bio-rad		software
Immidazole	Sangon Biotech	A500529-0100	solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore	WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents	Invitrogen	11668019	Transfection reagent
Na2HPO4	Sangon Biotech	A501727-0500	solvent
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	solvent
NaF	Sigma-Alddich	201154	solvent
NaH2PO4	Sangon Biotech	A501726-0500	solvent
Ni-NTA Agarose	QIAGEN	30230	nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane	GE healthcare	10600002	0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985-070	Transfection medium
PBS	Corning	21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution	Sangon Biotech	E607011-0100	antibiotic
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340
RPMI 1640	Biological Industries	01-100-1ACS	medium
Sarkosyl	Sigma-Alddich	L5777	solvent
SDS Loading Buffer	Beyotime	P0015L
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070	supplement
Tris-base	Sangon Biotech	A501492-0005	solvent
Tris-HCI	Sangon Biotech	A610103-0250	solvent
Triton X-100	Sangon Biotech	A110694-0500	reagent
Tween-20	Sangon Biotech	A100777-0500	supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System	Bio-rad		ChemiDoc XRS+
Urea	Sangon Biotech	A510907-0500	solvent