Purificação de proteínas p53 ubiquitinadas de células de mamíferos
Summary
O protocolo descreve um método passo-a-passo para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos usando a proteína supressora de tumor p53 como exemplo. As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas a partir de células sob rigorosas condições de não desnaturação e desnaturação.
Abstract
A ubiquitinação é um tipo de modificação pós-translacional que regula não apenas a estabilidade, mas também a localização e a função de uma proteína de substrato. O processo de ubiquitinação ocorre intracelularmente em eucariotas e regula quase todos os processos biológicos celulares básicos. A purificação de proteínas ubiquitinadas auxilia na investigação do papel da ubiquitinação no controle da função das proteínas do substrato. Aqui, um procedimento passo-a-passo para purificar proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos é descrito com a proteína supressora de tumor p53 como exemplo. As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas sob rigorosas condições de não desnaturação e desnaturação. A proteína p53 total celular marcada com Flag foi purificada com agarose conjugada com anticorpos anti-Flag em condições não desnaturantes. Alternativamente, a proteína ubiquitinada celular total marcada com His foi purificada usando resina carregada de níquel sob condições de desnaturação. As proteínas p53 ubiquitinadas nos eluídos foram detectadas com sucesso com anticorpos específicos. Usando este procedimento, as formas ubiquitinadas de uma determinada proteína podem ser eficientemente purificadas a partir de células de mamíferos, facilitando estudos sobre os papéis da ubiquitinação na regulação da função da proteína.
Introduction
A ubiquitina é uma proteína conservada evolutivamente de 76 aminoácidos 1,2,3. A ubiquitina liga-se covalentemente aos resíduos de lisina nas proteínas-alvo através de cascatas que envolvem enzimas ativadoras (E1), conjugantes (E2) e ligase (E3). A ubiquitina é ativada pela primeira vez pela enzima E1 e é então transferida para as enzimas conjugadoras E2. Posteriormente, os ligases de ubiquitina E3 interagem com enzimas E2 carregadas de ubiquitina e proteínas de substrato e mediam a formação de uma ligação isopeptídica entre o terminal C da ubiquitina e um resíduo de lisina no substrato 1,2,3,4,5. A ubiquitinação envolve a ligação de metades de ubiquitina a resíduos de lisina em proteínas do substrato ou a si mesma, levando à monoubiquitinação ou poliubiquitinação de proteínas. Este processo de ubiquitinação ocorre intracelularmente em eucariotas e regula uma grande variedade de processos biológicos. A ubiquitinação resulta na degradação de proteínas do substrato através do sistema ubiquitina-proteassoma 1,2,3,4,5. Além disso, a ubiquitinação modula a localização subcelular de proteínas, a formação de complexos proteicos e o tráfico de proteínas nas células 3,5. Parcelas de ubiquitina ligadas a proteínas de substrato podem ser removidas por enzimas desubiquitinantes (DUBs)6,7. Notavelmente, as diferentes maneiras pelas quais as cadeias de ubiquitina são montadas fornecem uma miríade de meios para regular vários processos biológicos 1,5. Os papéis exatos da ubiquitinação na regulação da função proteica do substrato permanecem incompletamente compreendidos até agora. A purificação de proteínas ubiquitinadas contribui para a elucidação dos efeitos da ubiquitinação de proteínas em uma variedade de processos celulares.
A proteína p53 é uma das mais importantes proteínas supressoras de tumor e apresenta mutações genéticas ou inativação em quase todos os cânceres humanos 8,9,10,11. A estabilidade e a atividade do p53 são delicadamente reguladas in vivo por modificações pós-traducionais, incluindo ubiquitinação, fosforilação, acetilação e metilação12,13. A proteína p53 tem uma meia-vida curta variando de 6 min a 40 min em várias células, o que resulta principalmente de sua poliubiquitinação e subsequente degradação proteassômica10,12. O duplo minuto 2 do rato (Mdm2) é uma ligase de ubiquitina E3 de p53 que se liga ao N-terminal de p53 para inibir sua atividade transcricional12,14,15. O Mdm2 promove a poliubiquitinação e degradação proteassômica do p53 para controlar sua estabilidade e induz a monoubiquitinação do p53 para facilitar sua exportação nuclear12,14,15,16. Aqui, a ubiquitinação p53 mediada por Mdm2 é usada como exemplo para introduzir um método para a purificação de proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos em detalhes. Os reguladores que influenciam o status de ubiquitinação das proteínas-alvo podem ser identificados usando este ensaio de ubiquitinação in vivo quando são superexpressos ou derrubados / nocauteados em células de mamíferos. Além disso, proteínas ubiquitinadas podem ser usadas como substratos para o ensaio de desubiquitinação in vitro. Uma triagem de alto rendimento pode ser realizada para identificar DUBs específicos para proteínas-alvo, incubando substratos ubiquitinados com DUBs individuais. As proteínas ubiquitinadas podem atuar como um andaime para recrutar proteínas de sinalização a jusante nas células. Um complexo proteico-alvo ubiquitinado pode ser purificado por imunoprecipitação sequencial em condições de purificação nativas e identificado por espectrometria de massa. O protocolo atual pode ser amplamente utilizado para investigar as proteínas celulares reguladas pela ubiquitinação.
Vários métodos têm sido estabelecidos para purificar proteínas ubiquitinadas, que incluem o uso de ubiquitina marcada com afinidade, anticorpos ubiquitina, proteínas ligadoras de ubiquitina e domínios isolados de ligação à ubiquitina (UBDs)17. Aqui, fornecemos um protocolo usando ubiquitina marcada com afinidade como mediador para purificar proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos. O uso de ubiquitina poli-His-tagged oferece vantagens sobre os outros métodos. As proteínas ubiquitinadas são purificadas na presença de desnaturantes fortes, o que reduz a ligação inespecífica à resina carregada de níquel, linearizando as proteínas celulares e interrompendo as interações proteína-proteína. Em contraste, o uso de anticorpos de ubiquitina, proteínas de ligação à ubiquitina e UBDs isoladas como mediadores não pode efetivamente excluir parceiros de ligação da proteína-alvo porque a purificação precisa ser realizada sob condições menos rigorosas. Além disso, a purificação também pode levar ao aumento da ligação de proteínas não relacionadas usando esses mediadores. Além disso, há uma propensão de ligação para vários tipos de ligação de ubiquitina, bem como mono e poli-ubiquitinação por proteínas ligadoras de ubiquitina ou UBDs isoladas17. O uso de ubiquitina poli-His-etiquetada contribui para puxar para baixo todas as proteínas ubiquitinadas celulares. Alternativamente, o uso de agarose conjugada com anticorpos anti-Flag ou anti-HA comercialmente disponíveis facilita a imunoprecipitação de proteínas-alvo marcadas com Flag ou HA em larga escala em condições não desnaturantes. Uma segunda etapa de purificação, por exemplo, por resina carregada de níquel visando ubiquitina poli-His-marcada, pode ser usada para adquirir proteínas-alvo ubiquitinadas com alta pureza para experimentos a jusante. Notavelmente, uma estratégia de purificação de marcação de epítopos pode ser adaptada quando um anticorpo específico não pode ser adquirido para imunoprecipitar proteínas-alvo de forma eficaz. Finalmente, a purificação de proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos, em comparação com a purificação in vitro, mantém o modo de ligação da ubiquitina das proteínas-alvo sob condições mais fisiológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A ubiquitinação desempenha um papel crítico em quase todos os processos celulares fisiológicos e patológicos2. Nos últimos anos, grandes progressos têm sido feitos na compreensão do papel molecular da ubiquitina nas vias de sinalização e como as mudanças no sistema de ubiquitina levam a diferentes doenças humanas2. A purificação de proteínas ubiquitinadas contribui para fornecer informações sobre os papéis exatos da ubiquitinação nesses processos. As mis…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81972624) para D.L.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
References
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