Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection에서 유전 된 면역 연구
Summary
microsporidian 기생충 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 웜이 동일한 병원균에 매우 저항력이있는 자손을 생산할 수있게합니다. 이것은 유전 된 면역의 예이며, 잘 이해되지 않는 후성 유전 적 현상입니다. 본 프로토콜은 유전적으로 견인성 웜 모델에서 유전된 면역의 연구를 기술한다.
Abstract
유전 된 면역은 일부 동물이 이전 감염의 “기억”을 자손에게 전달할 수있는 방법을 설명합니다. 이것은 자손의 병원균 내성을 높이고 생존을 촉진 할 수 있습니다. 유전 된 면역은 많은 무척추 동물에서보고되었지만,이 후성 유전 적 현상의 기초가되는 메커니즘은 크게 알려지지 않았습니다. 천연 microsporidian 병원균 Nematocida parisii에 의한 Caenorhabditis elegans의 감염은 microsporidia에 강력하게 저항하는 자손을 생산하는 웜을 초래합니다. 본 프로토콜은 단순하고 유전적으로 다루기 쉬운 N. parisii-C. elegans 감염 모델에서 세대 간 면역의 연구를 기술한다. 현재 기사는 C. elegans를 감염시키고 면역 프라이밍 된 자손을 생성하는 방법을 설명합니다. 현미경 검사에 대한 염색 및 현미경 검사에 의한 감염을 시각화하여 microsporidia 감염에 대한 내성을 분석하는 방법도 제공됩니다. 특히, 유전 된 면역은 미세 스포리디아에 의한 숙주 세포 침윤을 방지하고, 계내 혼성화 (FISH)에서의 형광은 침윤 사건을 정량화하는데 사용될 수 있다. 면역-프라이밍된 자손에서 생성된 미세 포자의 상대적 양은 포자를 키틴-결합 염료로 염색함으로써 정량화될 수 있다. 지금까지 이러한 방법은 유전 된 면역의 동역학 및 병원체 특이성뿐만 아니라 그 기초가되는 분자 메커니즘에 대해 밝혀 왔습니다. 이러한 기술은 C. elegans 연구에 사용할 수있는 광범위한 도구와 함께 유전 된 면역 분야에서 중요한 발견을 가능하게합니다.
Introduction
유전 된 면역은 병원균에 대한 부모의 노출로 감염 저항성 자손의 생산을 가능하게하는 후성 유전 적 현상입니다. 이러한 유형의 면역 기억은 적응 면역 체계가 부족하고 바이러스, 박테리아 및 곰팡이 질환으로부터 보호 할 수있는 많은 무척추 동물에서 나타났습니다1. 유전 된 면역은 건강과 진화를 이해하는 데 중요한 영향을 미치지 만,이 보호의 기초가되는 분자 메커니즘은 크게 알려지지 않았습니다. 이것은 부분적으로 유전 된 면역이 묘사 된 많은 동물들이 연구를위한 모델 유기체가 확립되지 않았기 때문입니다. 대조적으로, 투명한 선충류 Caenorhabditis elegans에 대한 연구는 광범위한 유전 및 생화학 적 툴킷 2,3, 고도로 주석이 달린 게놈 4,5 및 짧은 생성 시간의 이점을 얻습니다. 실제로 C. elegans의 연구는 후성 유전학 및 선천적 면역 6,7 분야에서 근본적인 발전을 가능하게했으며, 이제는 면역 기억 8,9을 연구하기위한 확립 된 모델입니다.
Microsporidia는 거의 모든 동물을 감염시키고 면역 저하 된 인간10에서 치명적인 감염을 일으키는 곰팡이 병원체입니다. 감염은 미세 스포리 디아 포자가 극성 튜브 (polar tube)라는 구조를 사용하여 세포 내용물 (스포로 플라즈마)을 숙주 세포에 주입하거나 “발사”할 때 시작됩니다. 기생충의 세포 내 복제는 메론트의 형성을 초래하며, 이는 궁극적으로 세포11,12를 빠져 나올 수있는 성숙한 포자로 분화됩니다. 이러한 기생충은 인간의 건강과 식량 안보 모두에 해롭지 만, 감염 생물학12에 대해 배울 것이 많이 있습니다. Nematocida parisii는 웜의 장 세포에서만 독점적으로 복제되는 천연 미세 스포리디안 기생충으로 번식력을 감소시키고 궁극적으로 사망을 초래합니다. N. parisii-C. elegans 감염 모델은 (1) 병원체 클리어런스에서 자가포식의 역할 13, (2) 미세 스포리디아가 감염된 세포를 비언어적으로 빠져 나올 수있는 방법14, (3) 병원체가 syncytia 15를 형성하여 세포 간 확산 할 수있는 방법, (4) 단백질 N. parisii가 숙주 (16)와 계면하기 위해 사용하는 방법, 및 (5) 전사 세포 내 병원체 반응(IPR)17, 18.
C. elegans의 감염에 대한 프로토콜은 현재 연구에 설명되어 있으며 독특한 microsporidia 생물학을 밝히고 감염에 대한 숙주의 반응을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 키틴 결합 염료 다이렉트 옐로우 96 (DY96)으로 염색된 고정 웜의 현미경 검사는 장 전체에 걸쳐 키틴 함유 미세 스포리디아 포자의 감염 확산을 보여줍니다. DY96 염색은 또한 숙주 적합성의 판독으로서 웜 중량 (배아를 생산하는 능력)의 동시 평가를 위해 키틴 함유 웜 배아의 시각화를 가능하게합니다.
최근 연구에 따르면 N. parisii에 감염된 C. elegans는 동일한 감염에 강하게 저항하는 자손을 생산합니다19. 이 유전 된 면역은 단일 세대에 지속되며 더 심하게 감염된 부모의 자손이 microsporidia에 더 강하기 때문에 용량에 따라 다릅니다. 흥미롭게도, N. parisii-primed 자손은 또한 박테리아 장내 병원균 인 Pseudomonas aeruginosa에 더 내성이 있지만, 천연 병원균 Orsay virus19로부터 보호되지는 않습니다. 본 연구는 또한 면역-프라이밍된 자손이 미세 스포리디아에 의한 숙주 세포 침윤을 제한한다는 것을 보여준다. 이 방법은 또한 면역-프라이밍된 자손의 수집과 FISH가 숙주 세포 침윤 및 포자 발사(20)를 분석하기 위해 장내 세포에서 N. parisii RNA를 검출하는데 어떻게 사용될 수 있는지를 기술한다.
함께,이 프로토콜은 C. elegans에서 microsporidia 및 유전 된 면역을 연구하기위한 견고한 토대를 제공합니다. 이 모델 시스템의 향후 연구가 유전 된 면역의 초기 분야에서 중요한 발견을 가능하게하기를 희망합니다. 이러한 기술은 또한 다른 숙주 유기체에서 미세 스포리디아 유도 유전 면역을 조사하기위한 출발점이 될 가능성이 큽니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 프로토콜은 단순하고 유전적으로 다루기 쉬운 N. parisii-C. elegans 감염 모델에서 microsporidia 및 유전 된 면역의 연구를 설명합니다.
포자 준비는 생산성24에 따라 일반적으로 6 개월의 실험 동안 충분한 포자를 산출하는 집중적 인 프로토콜입니다. 중요하게도, 감염성은 실험에 사용하기 전에 각각의 새로운 포자 “제비”에 대해 결정되어야 한다. ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고에 대한 유용한 의견을 제공 한 Winnie Zhao와 Yin Chen Wan에게 감사드립니다. 이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Grant #522691522691)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
- Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
- Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
- Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
- Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
- Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
- Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
- Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
- Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
- Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
- Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
- Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
- Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
- Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
- Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
- Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
- Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
- Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
- Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
- Troemel, E. R., Félix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
- Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
- Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
- Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).
