Изучение наследственного иммунитета в модели caenorhabditis elegans инфекции microsporidia
Summary
Заражение Caenorhabditis elegans микроспоридийным паразитом Nematocida parisii позволяет червям производить потомство, которое обладает высокой устойчивостью к одному и тому же патогену. Это пример унаследованного иммунитета, плохо изученного эпигенетического явления. Настоящий протокол описывает изучение унаследованного иммунитета в генетически податливой модели червя.
Abstract
Наследственный иммунитет описывает, как некоторые животные могут передать «память» о предыдущей инфекции своему потомству. Это может повысить устойчивость патогенов в их потомстве и способствовать выживанию. В то время как наследственный иммунитет был зарегистрирован у многих беспозвоночных, механизмы, лежащие в основе этого эпигенетического явления, в значительной степени неизвестны. Заражение Caenorhabditis elegans естественным микроспоридиевым патогеном Nematocida parisii приводит к тому, что черви производят потомство, которое устойчиво устойчиво к микроспоридиям. Настоящий протокол описывает изучение межпоколенческого иммунитета в простой и генетически поддающейся лечению модели инфекции N. parisii –C. elegans . В настоящей статье описаны методы заражения C. elegans и получения иммуно-праймированного потомства. Также приведены методы анализа устойчивости к микроспоридиозной инфекции путем окрашивания на микроспоридию и визуализации инфекции с помощью микроскопии. В частности, унаследованный иммунитет предотвращает инвазию клеток-хозяев микроспоридиями, а флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) может быть использована для количественной оценки событий инвазии. Относительное количество спор микроспоридии, продуцируемых в иммунно-праймированном потомстве, может быть количественно определено путем окрашивания спор хитин-связывающим красителем. На сегодняшний день эти методы пролили свет на кинетику и патогенную специфичность унаследованного иммунитета, а также на молекулярные механизмы, лежащие в его основе. Эти методы, наряду с обширными инструментами, доступными для исследований C. elegans , позволят сделать важные открытия в области унаследованного иммунитета.
Introduction
Наследственный иммунитет является эпигенетическим явлением, при котором родительское воздействие патогенов может обеспечить производство устойчивого к инфекции потомства. Этот тип иммунной памяти был показан у многих беспозвоночных, у которых отсутствует адаптивная иммунная система и которые могут защитить от вирусных, бактериальных и грибковых заболеваний1. В то время как унаследованный иммунитет имеет важные последствия для понимания как здоровья, так и эволюции, молекулярные механизмы, лежащие в основе этой защиты, в значительной степени неизвестны. Отчасти это связано с тем, что многие животные, у которых был описан унаследованный иммунитет, не являются установленными модельными организмами для исследований. Напротив, исследования прозрачной нематоды Caenorhabditis elegans извлекают выгоду из обширного генетического и биохимического инструментария 2,3, высоко аннотированного генома 4,5 и короткого времени генерации. Действительно, исследования c. elegans позволили добиться фундаментальных успехов в области эпигенетики и врожденного иммунитета 6,7, и в настоящее время это установленная модель для изучения иммунной памяти 8,9.
Микроспоридия являются грибковыми патогенами, которые заражают почти всех животных и вызывают смертельные инфекции у людей с ослабленным иммунитетом10. Инфекция начинается, когда спора микроспоридии вводит или «запускает» свое клеточное содержимое (спороплазму) в клетку-хозяина, используя структуру, называемую полярной трубкой. Внутриклеточная репликация паразита приводит к образованию меронтов, которые в конечном итоге дифференцируются в зрелые споры, которые могут выходить из клетки11,12. Хотя эти паразиты наносят ущерб как здоровью человека, так и продовольственной безопасности, еще многое предстоит узнать об их биологии инфекции12. Nematocida parisii – это естественный микроспоридиальный паразит, который реплицируется исключительно в кишечных клетках червей, что приводит к снижению плодовитости и, в конечном счете, гибели. Модель инфекции N. parisii –C. elegans была использована, чтобы показать: (1) роль аутофагии в клиренсе патогена13, (2) как микроспоридия может выходить из инфицированных клеток нелитически14, (3) как патогены могут распространяться от клетки к клетке, образуя синцитию15, (4) белки, используемые N. parisii для взаимодействия со своим хозяином16, и (5) регуляцию транскрипционного внутриклеточного ответа патогена (IPR)17, 18.
Протоколы заражения C. elegans описаны в текущей работе и могут быть использованы для выявления уникальной биологии микроспоридии и препарирования реакции хозяина на инфекцию. Микроскопия неподвижных червей, окрашенных хитин-связывающим красителем Direct Yellow 96 (DY96), показывает распространение инфекции хитинсодержащими спорами микроспоридий по всему кишечнику. Окрашивание DY96 также позволяет визуализировать хитинсодержащие эмбрионы червей для одновременной оценки гравидности червя (способности производить эмбрионы) в качестве считывания пригодности хозяина.
Недавняя работа показала, что C. elegans , инфицированные N. parisii , производят потомство, которое устойчиво устойчиво к той же инфекции19. Этот унаследованный иммунитет длится одно поколение и зависит от дозы, так как потомство от более сильно инфицированных родителей более устойчиво к микроспоридиям. Интересно, что потомство N. parisii-primed также более устойчиво к бактериальному кишечному патогену Pseudomonas aeruginosa, хотя они не защищены от естественного патогена вируса Orsay19. Настоящая работа также показывает, что иммунно-праймированное потомство ограничивает инвазию клеток хозяина микроспоридиями. Метод также описывает сбор иммунно-праймированного потомства и то, как FISH может быть использован для обнаружения N. parisii RNA в клетках кишечника для анализа инвазии клеток хозяина и сжигания спор20.
Вместе эти протоколы обеспечивают прочную основу для изучения микроспоридии и наследственного иммунитета у C. elegans. Есть надежда, что будущая работа в этой модельной системе позволит сделать важные открытия в зарождающейся области унаследованного иммунитета. Эти методы также, вероятно, станут отправными точками для исследования наследственного иммунитета, вызванного микроспоридией, у других организмов-хозяев.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящий протокол описывает изучение микроспоридии и наследственного иммунитета в простой и генетически поддающейся лечению модели инфекции N. parisii –C. elegans .
Подготовка спор представляет собой интенсивный протокол, который обычно дает достаточно спор в течени…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Винни Чжао и Инь Чэнь Вану за полезные комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (грант No 522691522691).
Materials
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | – | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | – | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | – | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | – | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | – | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
- Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
- Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
- Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
- Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
- Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
- Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
- Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
- Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
- Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
- Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
- Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
- Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
- Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
- Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
- Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
- Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
- Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
- Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
- Troemel, E. R., Félix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
- Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
- Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
- Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).
