JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

Published: March 02, 2022
doi:
10.3791/63658
, ,
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration,University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute,University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology,University of Pittsburgh School of Medicine

Summary

Dit protocol beschrijft de methodologie om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van een transgeen zebravismodel. Het aanpassen van het protocol om signaleringsroutemodulatie met behulp van farmacologische verbindingen op te nemen, is uitgebreid gedetailleerd. Een MATLAB-platform voor het kwantificeren van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie werd ontwikkeld en wordt gepresenteerd en besproken.

Abstract

Het retinale pigmentepitheel (RPE) bevindt zich aan de achterkant van het oog en vervult functies die essentieel zijn voor het behoud van de gezondheid en integriteit van aangrenzende retinale en vasculaire weefsels. Op dit moment heeft de beperkte herstelcapaciteit van RPE bij zoogdieren, die beperkt is tot kleine verwondingen, de vooruitgang in het begrijpen van in vivo RPE regeneratieve processen belemmerd. Hier wordt een gedetailleerde methodologie gegeven om de studie van in vivo RPE-reparatie met behulp van de zebravis te vergemakkelijken, een gewerveld model dat in staat is tot robuuste weefselregeneratie. Dit protocol beschrijft een transgeen nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ)-gemedieerd letselparadigma (rpe65a:nfsB-eGFP), dat resulteert in ablatie van de centrale tweederde van de RPE na 24 uur behandeling met MTZ, met daaropvolgend weefselherstel. De nadruk wordt gelegd op RPE-ablaties in larvale zebravissen en methoden voor het testen van de effecten van farmacologische verbindingen op RPE-regeneratie worden ook geschetst. Generatie en validatie van RpEGEN, een MATLAB-script dat is gemaakt om de kwantificering van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie te automatiseren, wordt ook besproken. Naast actieve RPE-reparatiemechanismen kan dit protocol worden uitgebreid naar studies van RPE-degeneratie en letselresponsen, evenals de effecten van RPE-schade op aangrenzende retinale en vasculaire weefsels, naast andere cellulaire en moleculaire processen. Dit zebravissysteem is veelbelovend bij het identificeren van genen, netwerken en processen die RPE-regeneratie en RPE-ziektegerelateerde mechanismen aansturen, met het langetermijndoel om deze kennis toe te passen op zoogdiersystemen en, uiteindelijk, in de richting van therapeutische ontwikkeling.

Introduction

De hierin beschreven methodologie beschrijft een protocol om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van larvale zebravissen. De RPE strekt zich uit over de achterkant van het oog en bevindt zich tussen de gelaagde lagen van het neurale netvlies en de laag vasculatuur die het vaatvlies vormt. Trofische ondersteuning, absorptie van fototoxisch licht en onderhoud van visuele cycluseiwitten zijn slechts enkele van de kritieke functies die de RPE uitvoert en die essentieel zijn voor het behoud van de gezondheid en integriteit van deze aangrenzende weefsels1. Schade aan RPE bij zoogdieren is te herstellen wanneer laesies klein zijn2; schade geleden door grotere verwondingen of progressieve degeneratieve ziekte is echter onomkeerbaar. Bij mensen leiden RPE-degeneratieve ziekten (bijv. leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en de ziekte van Stargardt) tot permanent verlies van het gezichtsvermogen en, met weinig beschikbare behandelingsopties, verminderde kwaliteit van leven van de patiënt. Het beperkte vermogen van RPE bij zoogdieren om zichzelf te herstellen heeft een kenniskloof gecreëerd op het gebied van RPE-regeneratieve processen. Gezien het robuuste regeneratieve vermogen van de zebravis in veel verschillende weefseltypen, is dit protocol ontwikkeld om een in vivo gewerveld systeem op te zetten om studies naar intrinsiek regenererende RPE te vergemakkelijken en mechanismen bloot te leggen die die respons stimuleren. Met behulp van het hier geschetste ablatieparadigma zijn de canonieke Wnt-signaleringsroute3, de mTOR-route4 en immuungerelateerde responsen5 geïdentificeerd als kritieke mediatoren van RPE-regeneratie, waarschijnlijk met overlappende functies.

In dit genetische ablatieparadigma brengen Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebravissen het bacteriële nitroreductase (NTR/nfsB) gen6 tot expressie, gefuseerd met eGFP onder controle van het RPE-versterkerelement, rpe65a7. Ablatie wordt bereikt door de prodrug, metronidazol (MTZ), toe te voegen aan het systeemwater dat zebravissen huisvest. Intracellulaire activering van MTZ door nitroreductase resulteert in DNA-crosslinking en apoptose in NTR/nfsB-tot expressie brengende cellen 8,9. Deze technologie is veel gebruikt in zebravissen om cellen van het netvlies10,11,12,13 en andere weefsels te aborteren8. Samen maken deze elementen gerichte expressie (rpe65a) van een induceerbare celablatiemethodologie (NTR/MTZ)8,9 en een fluorescerende marker (eGFP) voor visualisatie mogelijk.

Er bestaan ook andere interessante in vivo modellen die kunnen worden gebruikt om het regeneratieve potentieel van de RPE14 te bestuderen. Deze zijn breed en omvatten RPE-naar-retina transdifferentiatie post-retinectomie bij amfibieën, waarbij RPE-cellen die verloren gaan aan retinale hergroei worden vervangen15,16; RPE restauratie na letsel in de “super healing” MRL/MpJ muis17; en exogene stimulatie van RPE-proliferatie in een rattenmodel van spontane RPE en retinale degeneratie18, onder anderen. Er zijn ook in vitro modellen ontwikkeld, zoals volwassen menselijke RPE-stamcellen (RPESCs)19. Deze modellen zijn allemaal waardevolle hulpmiddelen die werken aan het blootleggen van de cellulaire processen die verband houden met RPE-regeneratie (bijv. Proliferatie, differentiatie, enz.); de zebravis is echter uniek in zijn vermogen tot intrinsiek RPE-herstel na ablatie.

Hoewel de methodologie hier is geschreven om zich te concentreren op het begrijpen van de mechanismen die RPE-regeneratie aansturen, kunnen de Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) – lijn en dit genetische ablatieprotocol worden gebruikt om andere cellulaire processen te bestuderen, zoals RPE-apoptose, RPE-degeneratie en het effect van RPE-letsel op aangrenzende retinale en vasculaire weefsels. Het ablatieprotocol kan ook worden gewijzigd om farmacologische manipulatie op te nemen, wat een handige voorlopige strategie is om signaalroutes van belang te screenen. Het blokkeren van de canonieke Wnt-route met behulp van Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20, is bijvoorbeeld aangetoond dat het de RPE-regeneratie3 schaadt. Dit werd hier herhaald om gebruikers door een farmacologisch manipulatie-experiment te leiden en als proof-of-concept te dienen om een MATLAB-script (RpEGEN) te valideren dat is gemaakt om RPE-regeneratie te kwantificeren op basis van herstel van pigmentatie. Net als de transgene lijn en het ablatieprotocol zijn de RpEGEN-scripts aanpasbaar en kunnen ze worden gebruikt om andere markers / cellulaire processen binnen de RPE te kwantificeren.

Protocol

Alle hierin beschreven methodologieën voldoen aan het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Pittsburgh. 1. Voorbereiding voorafgaand aan het verzamelen van zebravisembryo’s Stel de embryo-incubator in op 28,5°C. Bereid een 25x stockoplossing van de melanogeneseremmer, N-fenylethiourea (PTU)21,22. Deze stamoplossing wordt geschaald op basis van een gan…

Representative Results

Het is bekend dat het remmen van de canonieke Wnt-signaleringsroute de RPE-regeneratie van zebravissen aanzienlijk schaadt met behulp van het genetische ablatieparadigma (rpe65a: nfsB-eGFP) en farmacologische manipulatiemethodologie (IWR-1) beschreven in het protocol3. Dit experiment werd hier herhaald om een geautomatiseerde methode te valideren voor het kwantificeren van zebravis RPE-regeneratie op basis van pigmentatie. De hieronder samengevatte resultaten omvatten alle stappen van het…

Discussion

Dit protocol beschrijft methodologie om de RPE genetisch te aborteren en bestudeert mechanismen van degeneratie en regeneratie bij larvale-oude zebravissen. Dit protocol is ook met succes uitgevoerd bij volwassen zebravissen3, maar met minder uitgebreide karakterisering, daarom zijn larven hier de focus. Kritische aspecten van dit deel van het protocol (stappen 1-4) omvatten: 1) het toevoegen van 1,5x PTU aan embryo’s voorafgaand aan het begin van melanogenese, 2) het dechorioneren van met PTU beh…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het hierin beschreven werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (RO1-EY29410 tot J.M.G, en NIH CORE Grant P30-EY08098 tot de afdeling Oogheelkunde); het UPMC Immune Transplant & Therapy Center (aan L.L.L. en J.M.G.); en de E. Ronald Salvitti-leerstoel in oogheelkundig onderzoek (aan J.M.G.). Aanvullende steun werd ontvangen van de Wiegand Fellowship in Ophthalmology (aan L.L.L), de Eye & Ear Foundation of Pittsburgh, en een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness, New York, NY. Auteurs willen ook Amanda Platt bedanken voor technische assistentie en Dr. Hugh Hammer en het aquatische personeel voor uitstekende ondersteuning van de dierenverzorging.

Materials

Lab Material/Equipment
2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) Millipore Sigma D9542
6-well plates Fisher Scientific 07-200-83
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 05-539-13 Catalog number is for 50 mL tubes
Diamond tip scribing pen Fisher Scientific 50-254-51 Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % Fisher Scientific BP231 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Embryo incubator (large) Fisher Scientific 3720A
Embryo incubator (mini/tabletop) Labnet I5110A
Fluorescence stereo microscope Zeiss Axio Zoom.V16 Or similar, with 488 nm excitation laser/filter
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-4 Manufactured by Corning, non-sterile
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo Millipore Sigma 5.04462 Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements
Methylene blue (powder) Fisher Scientific BP117-100 Also available as a premade aqeuous solution
Metronidazole (MTZ) Millipore Sigma M3761 Check instiutional chemical waste disposal requirements
N-phenylthiourea (PTU) Millipore Sigma P7629 Check instiutional chemical waste disposal requirements
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free Fisher Scientific AA433689M Chemical waste, proper disposal required
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 10 cm diameter
Phosphate buffered saline (powder packets) Millipore Sigma P3813 Used to make 10 X PBS stock
Pronase Millipore Sigma PRON-RO
Shaking incubator Benchmark H2010 Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius
Stereo microscope Leica S9i Or similar, with transmitted light illumination
Student Dumont #5 forceps Fine Science Tools 91150-20 Fine-tipped forceps for manual dechorionation
Tabletop rotator/shaker Scilogex SK-D1807-E
Transfer pipette Millipore Sigma Z135003 3.2 mL bulb draw, non-sterile
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Pentair TRS1, TRS2, TRS5 Also available from Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Software Material
FIJI (Fiji is Just ImageJ) FIJI (Fiji is Just ImageJ) https://imagej.net/software/fiji/ Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats
GRAMM examples and how-tos MathWorks https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLAB MathWorks https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB support MathWorks https://www.mathworks.com/support.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Biologie du développement. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Biologie du développement. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. . Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  23. Hammer, H. S. . Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
  30. Leary, S., et al. . Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. . GitHub – ReadImageJROI Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021)
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).

Tags

Keywords: ZebrafishRetinal Pigment EpitheliumRPERegenerationNitroreductaseMetronidazoleMATLABRpEGENAblationTransgenicEGFPPTUPharmacological Treatment
check_url/fr/63658?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Leach, L. L., Fisher, G. B., Gross, J. M. Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium. J. Vis. Exp. (181), e63658, doi:10.3791/63658 (2022).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image