Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium
Summary
Este protocolo descreve a metodologia para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) usando um modelo transgênico de zebrafish. A adaptação do protocolo para incorporar a modulação da via de sinalização usando compostos farmacológicos é extensivamente detalhada. Uma plataforma MATLAB para quantificar a regeneração de RPE com base na pigmentação foi desenvolvida e é apresentada e discutida.
Abstract
O epitélio pigmento da retina (RPE) reside na parte de trás do olho e desempenha funções essenciais para manter a saúde e integridade dos tecidos adjacentes da retina e vascular. Atualmente, a capacidade reparativa limitada do RPE mamífero, que se restringe a pequenas lesões, tem dificultado o progresso na compreensão dos processos regenerativos in vivo RPE. Aqui, uma metodologia detalhada é fornecida para facilitar o estudo do reparo in vivo RPE utilizando o zebrafish, um modelo de vertebrado capaz de regeneração robusta do tecido. Este protocolo descreve um paradigma de lesão mediada por nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), que resulta em ablação dos dois terços centrais do RPE após tratamento de 24 horas com MTZ, com posterior recuperação tecidual. O foco é colocado em ablações de RPE em zebrafish larval e métodos para testar os efeitos de compostos farmacológicos na regeneração de RPE também são descritos. Também é discutida a geração e validação do RpEGEN, um script MATLAB criado para automatizar a quantificação da regeneração de RPE com base na pigmentação. Além dos mecanismos ativos de reparação de RPE, este protocolo pode ser expandido para estudos de degeneração de RPE e respostas de lesões, bem como os efeitos dos danos de RPE em tecidos adjacentes da retina e vascular, entre outros processos celulares e moleculares. Este sistema de zebrafish mantém uma promessa significativa na identificação de genes, redes e processos que impulsionam a regeneração do RPE e mecanismos relacionados à doença de RPE, com o objetivo de longo prazo de aplicar esse conhecimento a sistemas de mamíferos e, em última instância, ao desenvolvimento terapêutico.
Introduction
A metodologia aqui descrita detalha um protocolo para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) utilizando zebrafish larval. O RPE se estende sobre a parte de trás do olho e reside entre as camadas estratificadas da retina neural e a camada de vasculatura que constitui o coroide. Suporte trófico, absorção de luz fototóxica e manutenção de proteínas do ciclo visual são apenas algumas das funções críticas que o RPE desempenha que são essenciais para sustentar a saúde e a integridade desses tecidos adjacentes1. Os danos ao RPE mamífero são reparáveis quando as lesões são pequenas2; no entanto, os danos sofridos por lesões maiores ou doenças degenerativas progressivas são irreversíveis. Em humanos, as doenças degenerativas de RPE (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade (AMD) e doença de Stargardt levam à perda permanente da visão e, com poucas opções de tratamento disponíveis, diminuíram a qualidade de vida do paciente. A capacidade limitada de rpe mamífero para auto-reparação criou uma lacuna de conhecimento no campo dos processos regenerativos RPE. Dada a robusta capacidade regenerativa do zebrafish em muitos tipos diferentes de tecidos, este protocolo foi desenvolvido para estabelecer um sistema de vertebrados in vivo para facilitar estudos sobre a regeneração intrinseca do RPE e descobrir mecanismos que conduzem essa resposta. Usando o paradigma de ablação aqui descrito, a via de sinalização canônica Wnt3, a via mTOR4 e as respostas relacionadas à imunidade5 foram identificadas como mediadoras críticas da regeneração de RPE, provavelmente com funções sobrepostas.
Neste paradigma de ablação genética, o gene Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebrafish expressam o gene nitroreductase derivado da bactéria (NTR/nfsB)6 fundido ao eGFP sob controle do elemento melhorador RPE, rpe65a7. A ablação é alcançada adicionando o pró-drogas, metronidazol (MTZ), ao sistema de água que abriga zebrafish. A ativação intracelular de MTZ por nitroreductase resulta em cruzamento de DNA e apoptose em células expressasNTR/nfsB 8,9. Esta tecnologia tem sido amplamente utilizada em zebrafish para ablate células da retina 10,11,12,13 e outros tecidos 8. Juntos, esses elementos permitem a expressão direcionada (rpe65a) de uma metodologia de ablação celular indutível (NTR/MTZ)8,9 e um marcador fluorescente (eGFP) para visualização.
Outros modelos in vivo interessantes também existem que podem ser usados para estudar o potencial regenerativo do RPE14. Estes são amplos e incluem a transdiferenteição RPE-para-retina pós-retinoctomia em anfíbios, nos quais as células RPE perdidas para o recrescimento da retina são substituídas15,16; Restauração RPE pós-lesão no mouse MRL/MpJ “super curativo”17; e estimulação exógena da proliferação de RPE em um modelo de rato de RPE espontânea e degeneração da retina18, entre outros. Modelos in vitro, como células-tronco RPE humanas adultas (RPESCs)19 também foram desenvolvidos. Esses modelos são ferramentas valiosas que trabalham para desvendar os processos celulares relacionados à regeneração de RPE (por exemplo, proliferação, diferenciação, etc.); no entanto, o zebrafish é único em sua capacidade de reparo de RPE intrínseco pós-ablação.
Enquanto a metodologia aqui é escrita para focar na compreensão dos mecanismos que impulsionam a regeneração do RPE, a linha Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) e este protocolo de ablação genética poderiam ser utilizados para estudar outros processos celulares, como apoptose RPE, degeneração RPE e o efeito da lesão de RPE em tecidos de retina e vascular adjacentes. O protocolo de ablação também pode ser modificado para incluir manipulação farmacológica, que é uma estratégia preliminar conveniente para rastrear caminhos de sinalização de interesse. Por exemplo, bloquear a via canônica Wnt usando o Inibidor do Wnt Response-1 (IWR-1)20, mostrou-se prejudicado a regeneração de RPE3. Isso foi repetido aqui para orientar os usuários através de um experimento de manipulação farmacológica e servir como prova de conceito para validar um script MATLAB (RpEGEN) criado para quantificar a regeneração de RPE com base na recuperação da pigmentação. Como a linha transgênica e o protocolo de ablação, os scripts RpEGEN são adaptáveis e podem ser usados para quantificar outros marcadores/processos celulares dentro do RPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a metodologia para ablto genético do RPE e mecanismos de estudo de degeneração e regeneração em zebrafish envelhecidos em larvas. Este protocolo também foi realizado com sucesso em zebrafishadulto 3, mas com caracterização menos extensa, e é por isso que as larvas são o foco aqui. Aspectos críticos desta parte do protocolo (etapas 1-4) incluem: 1) adicionar 1,5x PTU a embriões antes do início da melanogênese, 2) descorioar embriões tratados com PTU em 2-3 dpf…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho aqui descrito foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (RO1-EY29410 a J.M.G, e nih CORE Grant P30-EY08098 para o Departamento de Oftalmologia); o Centro de Transplante e Terapia Imunológica da UPMC (para L.L.L. e J.M.G.); e a Cadeira E. Ronald Salvitti em Pesquisa oftalmológica (para J.M.G.). Apoio adicional foi recebido da Wiegand Fellowship em Oftalmologia (para L.L.L), da Eye & Ear Foundation de Pittsburgh, e de uma bolsa irrestrita da Research to Prevent Blindness, Nova York, NY. Os autores também desejam agradecer amanda Platt por assistência técnica e Dr. Hugh Hammer e a equipe aquática para um excelente apoio aos animais.
Materials
| Lab Material/Equipment | |||
| 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
| Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
| Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
| InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
| Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
| Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
| Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
| Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
| Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
| Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
| GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
| MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |
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