ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה
Summary
פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה להסרה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) באמצעות מודל של דגי זברה מהונדסים. התאמת הפרוטוקול לשילוב אפנון מסלול איתות באמצעות תרכובות פרמקולוגיות מפורטת בהרחבה. פלטפורמת MATLAB לכימות התחדשות RPE המבוססת על פיגמנטציה פותחה והוצגה ונדונה.
Abstract
אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) שוכן בחלק האחורי של העין ומבצע פונקציות החיוניות לשמירה על בריאותן ושלמותן של רקמות הרשתית וכלי הדם הסמוכות. נכון לעכשיו, יכולת התיקון המוגבלת של RPE של יונקים, המוגבלת לפציעות קטנות, עיכבה את ההתקדמות להבנת תהליכי התחדשות in vivo RPE. כאן, מתודולוגיה מפורטת מסופקת כדי להקל על המחקר של תיקון in vivo RPE תוך שימוש בדגי הזברה, מודל של בעלי חוליות המסוגל להתחדשות רקמות חזקה. פרוטוקול זה מתאר פרדיגמת פציעה מהונדסת בתיווך ניטרורדוקטאז/מטרונידזול (NTR/MTZ) (rpe65a:nfsB-eGFP), אשר גורמת לאבלציה של שני השלישים המרכזיים של ה-RPE לאחר טיפול של 24 שעות ב-MTZ, עם התאוששות רקמות לאחר מכן. הפוקוס מושם על אבלציות RPE בדגי זברה זחליים ומתווות גם שיטות לבדיקת ההשפעות של תרכובות פרמקולוגיות על התחדשות RPE. כמו כן נדון ביצירה ובאימות של RpEGEN, סקריפט MATLAB שנוצר כדי להפוך את הכימות של התחדשות RPE לאוטומטית המבוססת על פיגמנטציה. מעבר למנגנוני תיקון RPE פעילים, ניתן להרחיב פרוטוקול זה למחקרים על ניוון RPE ותגובות פציעה, כמו גם על ההשפעות של נזקי RPE על רקמות רשתית וכלי דם סמוכות, בין תהליכים תאיים ומולקולריים אחרים. מערכת דגי זברה זו טומנת בחובה הבטחה משמעותית בזיהוי גנים, רשתות ותהליכים המניעים התחדשות RPE ומנגנונים הקשורים למחלות RPE, במטרה ארוכת טווח ליישם ידע זה על מערכות יונקים, ובסופו של דבר, לקראת התפתחות טיפולית.
Introduction
המתודולוגיה המתוארת כאן מפרטת פרוטוקול להפחתה גנטית של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) תוך שימוש בדגי זברה זחליים. ה-RPE משתרע על גב העין ושוכן בין השכבות המרובדות של הרשתית העצבית לבין שכבת כלי הדם המרכיבה את הכורואיד. תמיכה טרופית, ספיגת אור פוטוטוקסי ושמירה על חלבוני מחזור הראייה הם רק חלק מהפונקציות הקריטיות שה-RPE מבצע, החיוניות לשמירה על הבריאות והשלמות של הרקמות הסמוכות הללו1. נזק ל- RPE של יונקים ניתן לתיקון כאשר הנגעים קטנים2; עם זאת, נזק שנגרם על ידי פציעות גדולות יותר או מחלה ניוונית מתקדמת הוא בלתי הפיך. בבני אדם, מחלות ניווניות RPE (למשל, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ומחלת סטארגרדט) מובילות לאובדן ראייה קבוע, ועם מעט אפשרויות טיפול זמינות, ירידה באיכות החיים של המטופלים. היכולת המוגבלת של יונקים RPE לתקן את עצמם יצרה פער ידע בתחום התהליכים הרגנרטיביים של RPE. בהתחשב ביכולת ההתחדשות החזקה של דגי הזברה בסוגי רקמות רבים ושונים, פרוטוקול זה פותח כדי להקים מערכת חוליות in vivo כדי להקל על מחקרים על RPE מתחדש במהותו ולחשוף מנגנונים המניעים תגובה זו. באמצעות פרדיגמת האבלציה המתוארת כאן, מסלול האיתות הקנוני Wnt3, מסלול mTOR4 ותגובות הקשורות למערכת החיסון5 זוהו כמתווכים קריטיים של התחדשות RPE, ככל הנראה עם פונקציות חופפות.
בפרדיגמה זו של אבלציה גנטית, Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 דגי זברה מבטאים את הגן nitroreductase שמקורו בחיידקים (NTR/nfsB)6 שהתמזג עם eGFP תחת שליטה של אלמנט משפר RPE, rpe65a7. אבלציה מושגת על ידי הוספת הפרודרוג, metronidazole (MTZ), למערכת מים המאכלסת דגי זברה. הפעלה תוך-תאית של MTZ על-ידי ניטרו-רדוקטאז גורמת להצלבת דנ”א ולאפופטוזיס בתאים המבטאים NTR/nfsB 8,9. טכנולוגיה זו נמצאת בשימוש נרחב בדגי זברה כדי לנטרל תאים של הרשתית 10,11,12,13 ורקמות אחרות 8. יחד, רכיבים אלה מאפשרים ביטוי ממוקד (rpe65a) של מתודולוגיית אבלציה של תאים אינדוקטיביים (NTR/MTZ)8,9 וסמן פלואורסצנטי (eGFP) להדמיה.
קיימים גם מודלים מעניינים אחרים של in vivo שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הפוטנציאל הרגנרטיבי של RPE14. אלה הם רחבים וכוללים טרנסדיפרנציה של RPE לרשתית לאחר כריתת רטין בדו-חיים, שבה תאי RPE שאבדו לצמיחה מחדש של הרשתית מוחלפיםב-15,16; שחזור RPE לאחר פציעה בעכבר MRL /MpJ “סופר מרפא”17; וגירוי אקסוגני של התפשטות RPE במודל חולדות של RPE ספונטני וניוון רשתית18, בין היתר. כמו כן פותחו מודלים במבחנה, כגון תאי גזע RPE אנושיים בוגרים (RPESCs)19. מודלים אלה הם כולם כלים חשובים הפועלים לחשיפת התהליכים התאיים הקשורים להתחדשות RPE (למשל, התפשטות, התמיינות וכו ‘); עם זאת, דג הזברה הוא ייחודי ביכולתו לתקן RPE פנימי לאחר אבלציה.
בעוד שהמתודולוגיה כאן נכתבה כדי להתמקד בהבנת המנגנונים המניעים את התחדשות ה-RPE, ניתן להשתמש בקו Tg(rpe65a:nfsB-eGFP) ובפרוטוקול אבלציה גנטי זה כדי לחקור תהליכים תאיים אחרים כגון אפופטוזיס RPE, ניוון RPE והשפעת פגיעה ב-RPE על רקמות רשתית וכלי דם סמוכות. ניתן גם לשנות את פרוטוקול האבלציה כך שיכלול מניפולציה פרמקולוגית, שהיא אסטרטגיה ראשונית נוחה לסינון מסלולי איתות מעניינים. לדוגמה, חסימת מסלול Wnt הקנוני באמצעות מעכב של Wnt Response-1 (IWR-1)20, הוכחה כפגיעה בהתחדשות RPE3. זה חזר על עצמו כאן כדי להדריך משתמשים בניסוי מניפולציה פרמקולוגית ולשמש הוכחת היתכנות לאימות סקריפט MATLAB (RpEGEN) שנוצר כדי לכמת התחדשות RPE בהתבסס על שחזור של פיגמנטציה. בדומה לקו המהונדס ולפרוטוקול האבלציה, סקריפטי RpEGEN ניתנים להתאמה וניתן להשתמש בהם כדי לכמת סמנים/תהליכים תאיים אחרים בתוך ה-RPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להפחתה גנטית של ה-RPE וחקר מנגנונים של התנוונות והתחדשות בדגי זברה בגיל הזחל. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה גם בדגי זברה בוגרים3 אך עם אפיון פחות נרחב, ולכן הזחלים הם המוקד כאן. היבטים קריטיים של חלק זה של הפרוטוקול (שלבים 1-4) כוללים: 1) הוספת 1.5x PTU לעוברים לפנ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה המתוארת כאן נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (RO1-EY29410 ל- J.M.G, ומענק הליבה של NIH P30-EY08098 למחלקה לרפואת עיניים); המרכז להשתלות וטיפול חיסוני UPMC (ל- L.L.L. ו- J.M.G.); והקתדרה ע”ש א. רונלד סלוויטי לחקר רפואת עיניים (ל-J.M.G.). תמיכה נוספת התקבלה ממלגת ויגנד ברפואת עיניים (ל-L.L.L), מקרן העין והאוזניים של פיטסבורג, ומענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, ניו יורק, ניו יורק. המחברים רוצים גם להודות לאמנדה פלאט על הסיוע הטכני ולד”ר יו האמר ולצוות האקוואטיקה על תמיכה מצוינת בטיפול בבעלי חיים.
Materials
| Lab Material/Equipment | |||
| 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI) | Millipore Sigma | D9542 | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
| Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | Catalog number is for 50 mL tubes |
| Diamond tip scribing pen | Fisher Scientific | 50-254-51 | Manufactured by Electron Microscopy Sciences, items similar to this part number are adequate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) ≥99.7 % | Fisher Scientific | BP231 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Embryo incubator (large) | Fisher Scientific | 3720A | |
| Embryo incubator (mini/tabletop) | Labnet | I5110A | |
| Fluorescence stereo microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | Or similar, with 488 nm excitation laser/filter |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-4 | Manufactured by Corning, non-sterile |
| InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endo | Millipore Sigma | 5.04462 | Manufactured by Calbiochem; 25 mM in DMSO; check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Methylene blue (powder) | Fisher Scientific | BP117-100 | Also available as a premade aqeuous solution |
| Metronidazole (MTZ) | Millipore Sigma | M3761 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| N-phenylthiourea (PTU) | Millipore Sigma | P7629 | Check instiutional chemical waste disposal requirements |
| Paraformaldehyde (16 % w/v) methanol free | Fisher Scientific | AA433689M | Chemical waste, proper disposal required |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 10 cm diameter |
| Phosphate buffered saline (powder packets) | Millipore Sigma | P3813 | Used to make 10 X PBS stock |
| Pronase | Millipore Sigma | PRON-RO | |
| Shaking incubator | Benchmark | H2010 | Used for incubating MTZ for 1 hour at 37 degrees Celcius |
| Stereo microscope | Leica | S9i | Or similar, with transmitted light illumination |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Fine-tipped forceps for manual dechorionation |
| Tabletop rotator/shaker | Scilogex | SK-D1807-E | |
| Transfer pipette | Millipore Sigma | Z135003 | 3.2 mL bulb draw, non-sterile |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Pentair | TRS1, TRS2, TRS5 | Also available from Fisher Scientific (NC0342409) |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Software Material | |||
| FIJI (Fiji is Just ImageJ) | FIJI (Fiji is Just ImageJ) | https://imagej.net/software/fiji/ | Version: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin needed: Bio-Formats |
| GRAMM examples and how-tos | MathWorks | https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like. | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Toolboxes needed to run RpEGEN: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox |
| MATLAB support | MathWorks | https://www.mathworks.com/support.html |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
- Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939 (2019).
- Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
- Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
- Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
- Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
- White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
- Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590 (2016).
- Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
- Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932 (2016).
- George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
- Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
- Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Biologie du développement. 303 (1), 45-56 (2007).
- Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
- McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43 (2019).
- Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
- Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Biologie du développement. 14 (1), 1-39 (1966).
- Westerfield, M. . Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2007).
- Hammer, H. S. . Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , 321-335 (2020).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132 (2012).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991 (2011).
- Leary, S., et al. . Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , (2020).
- Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- . GitHub – ReadImageJROI Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021)
- Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568 (2018).
- Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
- Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
- Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
- Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
- Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
- Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30 (2012).
- Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073 (2016).
- Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
- Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
- Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
- Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
- Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
- Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
- Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
- de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102 (2016).
