检测白纹伊蚊细胞系中的沃尔巴克氏体菌株 wAlbB
Summary
采用4种方法检测细胞内沃尔巴克氏体，相辅相成，提高了抗生素治愈白纹伊蚊来源的Aa23和Aa23-T感染的细菌感染的准确性。
Abstract
作为母体内共生体，沃尔巴克氏体感染了大部分昆虫种群。最近的研究报道了使用沃尔巴克氏体转染的蚊子成功调节RNA病毒传播。控制病毒的关键策略包括通过细胞质不相容性操纵宿主繁殖，以及通过免疫启动和竞争宿主来源资源来抑制病毒转录本。然而，沃尔巴克氏体转染蚊子对病毒感染反应的潜在机制知之甚少。本文提出了一种在白纹伊蚊（Diptera：Culicidae）Aa23细胞的核酸和蛋白质水平上体外鉴定沃尔巴克氏体感染的方案，以增强对沃尔巴克氏体与其昆虫载体之间相互作用的理解。通过结合使用聚合酶链反应（PCR）、定量PCR、免疫印迹和免疫学分析方法，已经描述了一种比使用单一方法更准确的用于检测沃尔巴克氏体感染细胞的标准形态学方案。这种方法也可用于检测其他昆虫分类群中的沃尔巴克氏体感染。
Introduction
亚洲虎蚊 白纹 伊蚊（Skuse）（双翅目：Culicidae）是亚洲和世界其他地区登革热病毒（DENV）的主要载体1，是两种类型的细胞内细菌的天然宿主， 沃尔巴克氏体 （wAlbA和 wAlbB），分布在整个种系和体细胞组织中2，3。来自 白纹 松胚胎的Aa23细胞系由至少两种形态细胞类型组成，这两种细胞都支持感染4 ，并且可以使用抗生素（Aa23-T）治愈天然 沃尔巴克氏体 感染。鉴于Aa23仅保留 wAlbB，它是研究宿主 – 内共生体相互作用4，5，6的有用模型。
沃尔巴克氏体是母体传播的，估计感染了65%的昆虫物种8，9和28%的蚊子物种10。它感染多种组织并与宿主形成亲密的共生关系，通常通过操纵宿主生殖系统12，13诱导细胞质不相容（CI）11和种群替代。在模拟果蝇14的自然种群和在实验室笼子和田间试验15的埃及伊蚊中观察到这些宿主反应。沃尔巴克氏体引发的一个重要的非生殖性操作是诱导宿主对各种病原体的抗性，包括DENV，基孔肯雅病毒（CHIKV）和西尼罗河病毒（WNV）16，17，这些病原体可能由共生体的先天免疫系统改善18，19介导，沃尔巴克氏体和病毒之间对基本宿主资源的竞争20，以及操纵宿主病毒防御途径21.
该方案是为研究 沃尔巴克氏体诱导的宿主抗病毒反应的这些潜在机制而开发的。它使用四种方法检测Aa23细胞的细胞内 沃尔巴克氏体 感染。这些方法为研究其他宿主物种的细胞内 沃尔巴克氏体 感染提供了强有力的理论基础。第一种方法，PCR – 一种强大的技术，允许在不使用常规克隆程序的情况下酶扩增DNA的特定区域 – 用于检测 沃尔巴克氏体 DNA并确定 是否存在沃尔巴克氏体 感染22。第二种方法是使用定量PCR（qPCR）测量 沃尔巴克氏体 DNA拷贝密度，以可靠地检测和测量每个PCR循环中产生的产物，该产物与PCR23之前的模板量成正比。第三种方法使用蛋白质印迹检测细胞内 沃尔巴克氏体 蛋白的存在 – 这是通过结合电泳的高分离能力，抗体的特异性和显色酶促反应的敏感性来检测复杂混合物中特定蛋白质的最强大工具之一。最后一种方法是免疫荧光测定（IFA），结合免疫学，生物化学和显微镜，通过抗原抗体反应检测 沃尔巴克氏体 表面蛋白（wsp），以确认 沃尔巴克氏体的 细胞摄取并确定其细胞定位。
本文介绍了上述四种验证细胞中 沃尔巴克氏体 存在的方法，可用于检测外源性 沃尔巴克氏体 是否成功转染，细胞内的 沃尔巴克氏体 是否被清除。在确定细胞中是否存在 沃尔巴克氏体 后，可以进行各种不同的分析，包括基因组学，蛋白质组学或代谢组学。该协议演示了通过Aa23细胞检测 沃尔巴克氏体 ，但也可用于其他细胞。
Protocol
1. 材料和试剂 使用无热原溶液和培养基进行细胞培养（参见 材料表）。 使用超纯水制备所有溶液。 在选择用于细胞培养的胎牛血清（FBS）时要小心，遵循批次检查过程。注意：由于FBS批次可能会定期更改，因此无法在该协议中说明相关目录和批号。 选择来自 白纹 松卵的Aa23细胞株，对应于无 沃尔巴克氏体Aa23-T。 <p…
Representative Results
在检测到沃尔巴克氏体之前，在光学显微镜下观察Aa23和Aa23-T细胞，以确定两种细胞系之间的任何形态差异。Aa23和Aa23-T细胞至少具有两种细胞形态，但两种细胞类型之间没有明显的形态差异（图1）。在这里，Aa23细胞被用作使用四种方法检测沃尔巴克氏体感染的模型系统。使用诊断引物81F/691R对Wolbachiawsp基因进行阳性扩增在Aa23细胞（泳?…
Discussion
细胞内 沃尔巴克氏体 感染的检测对于研究 沃尔巴克氏体-宿主相互作用和确认新菌株细胞的成功转染至关重要。在该方案中，使用了四种方法在核酸和蛋白质水平上成功检测细胞内 沃尔巴克氏体 感染。这四种实验方法证实并提高了 沃尔巴克氏体 感染细胞的检测精度。
PCR用于在核酸水平上检测细胞 的沃尔巴克氏体 感染的存在。然而，由于…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢明尼苏达大学的王新茹博士提供有见地的建议和指导。本研究由国家自然科学基金（No.81760374）资助。
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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Citer Cet Article
Chen, L., Xiao, Q., Shi, M., Cheng, J., Wu, J. Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines. J. Vis. Exp. (184), e63662, doi:10.3791/63662 (2022).