Détection de la souche wAlbB de Wolbachia dans les lignées cellulaires d’Aedes albopictus
Summary
Quatre méthodes ont été utilisées pour détecter les Wolbachia intracellulaires, qui se complétaient et amélioraient la précision de la détection de l’infection à Wolbachia de aa23 dérivé d’Aedes albopictus et de l’Aa23-T guéris de l’infection native de Wolbachia à l’aide d’antibiotiques.
Abstract
En tant qu’endosymbiote domestique de la mère, Wolbachia infecte de grandes proportions de populations d’insectes. Des études ont récemment rapporté la régulation réussie de la transmission du virus à ARN à l’aide de moustiques transfectés par Wolbachia. Les stratégies clés pour contrôler les virus comprennent la manipulation de la reproduction de l’hôte par incompatibilité cytoplasmique et l’inhibition des transcriptions virales par l’amorçage immunitaire et la concurrence pour les ressources dérivées de l’hôte. Cependant, les mécanismes sous-jacents des réponses des moustiques transfectés par Wolbachia à l’infection virale sont mal compris. Cet article présente un protocole pour l’identification in vitro de l’infection à Wolbachia aux niveaux d’acide nucléique et de protéines dans les cellules Aa23 d’Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) afin d’améliorer la compréhension des interactions entre Wolbachia et ses insectes vecteurs. Grâce à l’utilisation combinée de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), de la PCR quantitative, du transfert western et des méthodes d’analyse immunologique, un protocole morphologique standard a été décrit pour la détection des cellules infectées par Wolbachia qui est plus précis que l’utilisation d’une seule méthode. Cette approche peut également être appliquée à la détection de l’infection à Wolbachia dans d’autres taxons d’insectes.
Introduction
Le moustique tigre asiatique Aedes albopictus (Skuse) (Diptères: Culicidae), qui est un vecteur clé du virus de la dengue (DENV) en Asie et dans d’autres parties du monde1, est un hôte naturel de deux types de bactéries intracellulaires, Wolbachia (wAlbA et wAlbB), qui sont réparties dans toute la lignée germinale et le tissu somatique 2,3. La lignée cellulaire Aa23 dérivée d’embryons d’A. albopictus se compose d’au moins deux types de cellules morphologiques, qui soutiennent tous deux l’infection4 et peuvent être guéris de l’infection native de Wolbachia à l’aide d’antibiotiques (Aa23-T). Étant donné que Aa23 ne conserve que wAlbB, c’est un modèle utile pour l’étude des interactions hôte-endosymbiote 4,5,6.
Wolbachia est transmis par la mère et infecte environ 65% des espèces d’insectes 8,9 et 28% des espèces de moustiques10. Il infecte une variété de tissus et forme une relation symbiotique intime avec l’hôte, induisant généralement une incompatibilité cytoplasmique (IC)11 et un remplacement de la population en manipulant le système reproducteur hôte12,13. Ces réponses de l’hôte ont été observées dans des populations naturelles de Drosophila simulans14 et chez A. aegypti dans une cage de laboratoire et un essai sur le terrain15. Une manipulation non reproductrice importante provoquée par Wolbachia est la résistance induite de l’hôte à une variété d’agents pathogènes, y compris le DENV, le virus Chikungunya (CHIKV) et le virus du Nil occidental (VNO)16,17, qui peut être médiée par un système immunitaire inné amélioré du symbiote18,19, la compétition entre Wolbachia et les virus pour les ressources essentielles de l’hôte20 et la manipulation des voies de défense virale de l’hôte21 .
Ce protocole a été développé pour étudier ces mécanismes sous-jacents des réponses antivirales de l’hôte induites par Wolbachia. Il utilise quatre méthodes de détection de l’infection intracellulaire à Wolbachia des cellules Aa23. Ces méthodes fournissent une base théorique solide pour les études de l’infection intracellulaire à Wolbachia d’autres espèces hôtes. La première méthode, la PCR – une technique puissante permettant l’amplification enzymatique de régions spécifiques de l’ADN sans utiliser de procédures de clonage conventionnelles – a été utilisée pour détecter l’ADN de Wolbachia et déterminer la présence / absence d’infection à Wolbachia 22. La deuxième méthode mesure la densité de copie de l’ADN de Wolbachia à l’aide de la PCR quantitative (qPCR) pour une détection et une mesure fiables des produits générés au cours de chaque cycle de PCR qui est directement proportionnelle à la quantité de gabarit avant la PCR23. La troisième méthode détecte la présence de protéines intracellulaires de Wolbachia , en utilisant le transfert de Western, l’un des outils les plus puissants pour détecter des protéines spécifiques dans des mélanges complexes en combinant le pouvoir de séparation élevé de l’électrophorèse, la spécificité des anticorps et la sensibilité des réactions enzymatiques chromogènes. La dernière méthode est un test d’immunofluorescence (IFA) qui combine l’immunologie, la biochimie et la microscopie pour détecter la protéine de surface de Wolbachia (wsp) par une réaction antigène-anticorps afin de confirmer l’absorption cellulaire de Wolbachia et de déterminer sa localisation cellulaire.
Cet article décrit les quatre méthodes énumérées ci-dessus pour vérifier l’existence de Wolbachia dans les cellules, qui peuvent être utilisées pour détecter si le Wolbachia exogène a été transfecté avec succès et si le Wolbachia dans la cellule a été éliminé. Après avoir déterminé si Wolbachia est présent dans les cellules ou non, une variété d’analyses différentes peuvent être effectuées, y compris la génomique, la protéomique ou la métabolomique. Ce protocole démontre la détection de Wolbachia à travers les cellules Aa23 mais peut également être utilisé dans d’autres cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
La détection de l’infection intracellulaire à Wolbachia est essentielle pour l’étude des interactions Wolbachia-hôte et la confirmation de la transfection réussie des cellules avec de nouvelles souches. Dans ce protocole, quatre méthodes ont été utilisées pour détecter avec succès l’infection intracellulaire à Wolbachia aux niveaux d’acide nucléique et de protéines. Ces quatre méthodes expérimentales ont corroboré et amélioré la précision de détection de l’infecti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Xin-Ru Wang de l’Université du Minnesota pour ses suggestions et ses conseils perspicaces. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (No.81760374).
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
References
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