זיהוי זן וולבצ'יה wAlbB ב Aedes albopictus קווי תאים

Summary

ארבע שיטות שימשו לאיתור וולבצ’יה תוך-תאית, אשר השלימו זו את זו ושיפרו את דיוק הזיהוי של זיהום וולבצ’יה של Aa23 שמקורו ב-Aedes albopictus ו-Aa23-T שנרפאו מזיהום וולבצ’יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה.

Abstract

כאנדוסימביונטית בעלת נמל אימהי, וולבצ’יה מדביקה שיעורים גדולים של אוכלוסיות חרקים. מחקרים דיווחו לאחרונה על ויסות מוצלח של העברת נגיפי RNA באמצעות יתושים שעברו טרנספקציה של וולבצ’יה. אסטרטגיות מרכזיות לשליטה בווירוסים כוללות מניפולציה של רבייה של מארח באמצעות אי-תאימות ציטופלסמית ועיכוב של תעתיקים נגיפיים באמצעות תעתיקים חיסוניים ותחרות על משאבים שמקורם במארח. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים של התגובות של יתושים שעברו וולבצ’יה לזיהום ויראלי אינם מובנים היטב. מאמר זה מציג פרוטוקול לזיהוי במבחנה של זיהום וולבצ’יה ברמות חומצת הגרעין והחלבון בתאי Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 כדי לשפר את ההבנה של יחסי הגומלין בין וולבצ’יה לבין וקטורים החרקים שלה. באמצעות שימוש משולב בתגובת שרשרת פולימראז (PCR), PCR כמותי, כתם מערבי ושיטות אנליטיות אימונולוגיות, תואר פרוטוקול מורפולוגי סטנדרטי לזיהוי תאים נגועים בוולבצ’יה שהוא מדויק יותר משימוש בשיטה אחת. גישה זו עשויה להיות מיושמת גם על זיהוי של זיהום וולבצ’יה בטקסות חרקים אחרות.

Introduction

יתוש הטיגריס האסייתי Aedes albopictus (Skuse) (דיפטרה: Culicidae), שהוא וקטור מפתח של נגיף הדנגי (DENV) באסיה ובחלקים אחרים של העולם¹, הוא מארח טבעי של שני סוגים של החיידקים התוך תאיים, וולבצ’יה (wAlbA ו-wAlbB), המופצים לאורך קו הנבט והרקמה הסומטית ^2,3. קו התאים Aa23 שמקורו בעוברי A. albopictus מורכב משני סוגי תאים מורפולוגיים לפחות, שניהם תומכים בזיהום⁴ וניתן לרפא אותם מזיהום וולבצ’יה מקומי באמצעות אנטיביוטיקה (Aa23-T). בהתחשב בכך ש- Aa23 שומר רק על wAlbB, זהו מודל שימושי לחקר אינטראקציות פונדקאי-אנדוסימביונט ^4,5,6.

וולבצ’יה מועברת באופן אימהי ומדביקה כ-65% ממיני החרקים ^8,9 ו-28% ממיני היתושים^{בני 10}. הוא מדביק מגוון רקמות ויוצר מערכת יחסים סימביוטית אינטימית עם המארח, בדרך כלל גורם לחוסר תאימות ציטופלסמית (CI)¹¹ ולהחלפת אוכלוסייה על ידי מניפולציה של מערכת הרבייה המארחת ^12,13. תגובות פונדקאיות אלה נצפו באוכלוסיות טבעיות של דרוזופילה סימולנס¹⁴ וב-A. aegypti בכלוב מעבדה ובניסוי שדה¹⁵. מניפולציה לא-רבייתית חשובה שנוצרה על ידי וולבצ’יה היא עמידות מארח מושרית למגוון פתוגנים, כולל DENV, נגיף צ’יקונגוניה (CHIKV) ונגיף הנילוס המערבי (WNV)^16,17, שעשוי להיות מתווך על ידי מערכת חיסונית מולדת משופרת של הסימביונט^18,19, תחרות בין וולבצ’יה לנגיפים על משאבים מארחים חיוניים²⁰, ומניפולציה של מסלולי הגנה נגיפיים מארחים²¹ .

פרוטוקול זה פותח לחקר המנגנונים הבסיסיים האלה של תגובות אנטי-ויראליות של פונדקאי המושרה על-ידי וולבצ’יה. הוא משתמש בארבע שיטות לגילוי של זיהום וולבצ’יה תוך תאי של תאי Aa23. שיטות אלה מספקות בסיס תיאורטי חזק למחקרים על זיהום וולבצ’יה תוך-תאי של מינים מארחים אחרים. השיטה הראשונה, PCR – טכניקה רבת עוצמה המאפשרת הגברה אנזימטית של אזורים ספציפיים בדנ”א מבלי להשתמש בהליכי שיבוט קונבנציונליים – שימשה לאיתור דנ”א של וולבצ’יה ולקבוע את נוכחותו/היעדרו של זיהום וולבצ’יה ²². השיטה השנייה מודדת את צפיפות העתקת הדנ”א של וולבצ’יה באמצעות PCR כמותי (qPCR) לזיהוי ומדידה אמינים של מוצרים שנוצרו במהלך כל מחזור PCR, אשר פרופורציונלי ישירות לכמות התבנית לפני PCR²³. השיטה השלישית מזהה נוכחות של חלבוני וולבצ’יה תוך-תאיים, תוך שימוש בכתם מערבי – אחד הכלים החזקים ביותר לאיתור חלבונים ספציפיים בתערובות מורכבות על ידי שילוב של כוח ההפרדה הגבוה של אלקטרופורזה, הספציפיות של נוגדנים ורגישות של תגובות אנזימטיות כרומוגניות. השיטה הסופית היא בדיקת אימונופלואורסצנציה (IFA) המשלבת אימונולוגיה, ביוכימיה ומיקרוסקופיה כדי לזהות את חלבון פני השטח של וולבצ’יה (wsp) באמצעות תגובת אנטיגן-נוגדן כדי לאשר את הספיגה התאית של וולבצ’יה ולקבוע את לוקליזציה התאית שלה.

מאמר זה מתאר את ארבע השיטות המפורטות לעיל כדי לאמת את קיומה של וולבצ’יה בתאים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לזהות אם וולבצ’יה האקסוגנית עברה בהצלחה טרנספקציה והוולבצ’יה בתא נוקתה. לאחר קביעה אם וולבצ’יה קיימת בתאים או לא, ניתן לבצע מגוון ניתוחים שונים, כולל גנומיקה, פרוטאומיקה או מטבוליקה. פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי של וולבצ’יה באמצעות תאי Aa23, אך ניתן להשתמש בו גם בתאים אחרים.

Protocol

1. חומרים וריאגנטים השתמש בתמיסות ובמדיה ללא פירוגן עבור תרבית תאים (ראה טבלת החומרים). השתמש במים אולטרה-פורים כדי להכין את כל הפתרונות. היזהרו בבחירת סרום בקר עוברי (FBS) לתרבית תאים, לאחר תהליך בדיקה רב.הערה: מכיוון שהרבה FBS כפופים לשינויים קבועים, אי אפש…

Representative Results

לפני שוולבצ’יה זוהתה, תאי Aa23 ו-Aa23-T נצפו תחת מיקרוסקופ אור כדי לקבוע הבדלים מורפולוגיים בין שני קווי התאים. לתאי Aa23 ו-Aa23-T יש לפחות שתי מורפולוגיות של תאים, אך אין הבדל מורפולוגי ברור בין שני סוגי התאים (איור 1). כאן, תאי Aa23 שימשו כמערכת מודל לזיהוי זיהום וולבצ’יה…

Discussion

זיהוי של זיהום וולבצ’יה תוך-תאי חיוני לחקר אינטראקציות וולבצ’יה-מארח ולאישור של טרנספקציה מוצלחת של תאים עם זנים חדשים. בפרוטוקול זה, ארבע שיטות שימשו כדי לזהות בהצלחה זיהום וולבצ’יה תוך תאי ברמות חומצת הגרעין והחלבון. ארבע שיטות ניסיוניות אלה אימתו ושיפרו את דיוק הזיהוי של ?…

Materials

Microscope	Zeiss		SteREO Discovery V8
Petri dish	Fisher Scietific	FB0875713
Pipette	Pipetman	F167380	P10
inSituX platform
Analysis software	In-house developed
Cerium doped yttrium aluminum garnet	MSE Supplies		Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates
Chip holder	In-house developed
Control software	In-house developed
Immersion oil	Cargille Laboratories	16482	Type A low viscosity 150 cSt
inSituX platform	In-house developed
IR light source	Thorlabs Incorporated	LED1085L	LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18
Outer ring	In-house developed
Pump lasers	Thorlabs Incorporated	LD785-SE400	785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode
Raspberry Pi	Raspberry Pi Fundation
Retaining ring	Thorlabs Incorporated	SM1RR	SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts
Seedless quartz crystal	University Wafers, Inc.	U01-W2-L-190514	25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X
Shim	In-house developed
X-ray beam stop	In-house developed