細胞および組織におけるグルコース取り込みの間接的尺度としての細胞外グルコース枯渇 Ex vivo
Summary
蛍光標識されたグルコースの細胞外枯渇は、グルコース取り込みと相関し、摘出した臓器および細胞培養物におけるグルコース取り込みのハイスループットスクリーニングに使用することができる。
Abstract
糖尿病の世界的な流行が続いているため、グルコースの取り込みに影響を与える環境的、栄養的、内分泌的、遺伝的、およびエピジェネティックな要因の同定に対する需要が高まっています。細胞内蛍光の測定は、インビトロで細胞内の蛍光標識グルコース(FD-グルコース)の取り込みをテストするため、または インビボでグルコースを消費する組織をイメージングするために広く使用されている 方法です。このアッセイは、選択された時点におけるグルコース取り込みを評価する。細胞内分析は、FD-グルコースの代謝が内因性グルコースの代謝よりも遅いと仮定し、これは異化および同化反応およびシグナル伝達に関与する。しかし、動的グルコース代謝はまた、取り込み機構を変化させ、これは異なる因子に応答してグルコース取り込みの速度論的測定を必要とするであろう。本稿では、細胞外FD-グルコース枯渇を測定する方法について説明し、 エキソビボの細胞および組織における細胞内FD-グルコース取り込みとの相関を検証します。細胞外グルコース枯渇は、ハイスループットの動態学的および用量依存的研究、ならびに血糖活性およびそれらの組織特異的効果を有する化合物の同定に潜在的に適用され得る。
Introduction
グルコース取り込みを測定するための需要は、グルコース代謝に依存する多数の疾患の流行の増加に対処するための重要な必要性とともに上昇する。変性代謝疾患の根底にあるメカニズムは、神経学的および認知障害1、炎症性2および感染症3、癌4、5、ならびに加齢6について、エネルギーおよびその貯蔵、同化プロセス、タンパク質、および遺伝子修飾、シグナル伝達、遺伝子の調節、ならびに核酸合成および複製のためのグルコース代謝に依存する7,8,9.真性糖尿病(DM)は、グルコース取り込み調節の機能不全に直接関係している。DMは、1型、-2型、および-3型真性糖尿病、妊娠糖尿病、若年者の成熟発症糖尿病、および環境的および/または遺伝的要因によって誘発される他のタイプのこの疾患などの慢性疾患のスペクトルである。2016年、糖尿病に関する最初のWHOグローバルレポートは、最も広範なDMとともに生きる成人の数が1980年以来ほぼ4倍に増加し、成人10人の4億2,200万人に増加し、このDM患者の数は過去数十年間指数関数的に増加していることを実証しました。2019年だけでも、推定150万人の死亡がDM10によって直接引き起こされました。この劇的な上昇は、タイプ2 DMの増加と、太りすぎや肥満を含むそれを駆動する状態によるものです10。COVID-19のパンデミックは、一般集団と比較してDM患者の死亡率が2倍に増加することを明らかにし、免疫防御におけるグルコース代謝の深遠でありながらあまり理解されていない役割を示唆しています3。DM、肥満、およびその他の疾患の予防、早期診断、および治療には、異なる組織によるグルコース取り込みの測定の最適化、およびグルコース取り込みに影響を及ぼす環境11、栄養12、内分泌13、遺伝的14、およびエピジェネティック15因子の同定が必要である。
研究において、グルコースの細胞内および/または組織内取り込みは、一般に、インビトロ16、17、18およびインビボ19で蛍光標識されたグルコース(FD-グルコース)によって測定される。FD-グルコースは、放射性標識グルコース20、分析質量分析21、メタボロミクス22、核磁気共鳴法23、陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影法(PET/CT)5,24を用いたより正確な方法と比較して好ましい方法となった。FD-グルコース取り込みとは異なり、より多くの生物学的材料を必要とする分析方法は、多段階のサンプル調製、高価な機器、および複雑なデータ分析を含む可能性がある。細胞培養におけるFD-グルコース取り込みの効果的かつ安価な測定は、概念実証実験で利用されており、他の方法による検証が必要な場合がある。
グルコース取り込み研究のためのFD-グルコース適用の基礎は、内因性グルコースと比較してFD-グルコースの代謝の低下である25。それにもかかわらず、内因性グルコースおよびFDグルコースの両方が、同化、異化、およびシグナル伝達プロセスで使用するために、すべての細胞コンパートメント間で動的に分布する。FD-グルコースの区画化および時間依存性処理25 は、蛍光測定を妨害し、ハイスループットスクリーニング実験、速度論的分析、3D細胞培養、共培養、および組織外植実験におけるこのアッセイの使用のための主要な制限因子を表す。ここでは、FD-グルコースの細胞外枯渇とその細胞内取り込みとの間に高い相関関係を示すデータを提供し、細胞内グルコース取り込みの代理測定としてのFD-グルコースの細胞外枯渇を示唆する。グルコースの細胞外枯渇の測定を、インスリンおよび実験薬物18 で処置したマウスにおけるグルコース取り込みの組織特異的差異を検証するために適用し、この方法の原理証明を提供する。
現在のプロトコールは、3T3-L1細胞におけるFDグルコース取り込みの細胞内および細胞外(図1)測定値を記載している。プロトコルセクション1〜7は、48時間の細胞の培養および増殖を説明する。細胞飢餓、刺激、およびベースライン細胞外測定;細胞外FD-グルコースの刺激後測定およびFD-グルコースおよびタンパク質の細胞内測定。プロトコールセクション8は、他の箇所に記載されるインスリンおよびアミノ酸化合物2(AAC2)の存在下および非存在下でob/obマウスから解剖された組織におけるFDグルコースの細胞外取り込みのエクスビボ測定を記載している18。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞外FD-グルコース枯渇と細胞培養における正規化された細胞内グルコース取り込みとの直接比較は高い相関関係を示し、細胞外グルコース枯渇がグルコース取り込み評価のための代理測定である可能性があることを示唆した。細胞外FD-グルコースの測定には、広範囲のFDグルコース濃度を使用することができ、また、0.5-2.5μgのFD-グルコース/mLが最適な範囲を提供するようである。細胞外FD-?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst AwardとKathleen Kelly Awardの支援を受けました。その他の支援には、国立研究資源センターUL1RR025755およびNIH医学研究ロードマップであるNCI P30CA16058(OSUCCC)が含まれていました。コンテンツは著者の責任であり、国立研究資源センターまたはNIHの公式見解を表すものではありません。
Materials
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
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