Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi
Summary
Floresan olarak etiketlenmiş glikozun hücre dışı tükenmesi, glikoz alımı ile ilişkilidir ve eksize edilmiş organlarda ve hücre kültürlerinde glikoz alımının yüksek verimli taranması için kullanılabilir.
Abstract
Dünya çapında devam eden diyabet salgını, glikoz alımını etkileyen çevresel, beslenme, endokrin, genetik ve epigenetik faktörlerin tanımlanmasına olan talebi artırmaktadır. Hücre içi floresan ölçümü, in vitro hücrelerde floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) alımını test etmek veya glikoz tüketen dokuları in vivo olarak görüntülemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu tahlil, seçilen bir zaman noktasında glikoz alımını değerlendirir. Hücre içi analiz, FD-glikoz metabolizmasının, katabolik ve anabolik reaksiyonlara ve sinyalleşmeye katılan endojen glikozunkinden daha yavaş olduğunu varsayar. Bununla birlikte, dinamik glikoz metabolizması, farklı faktörlere yanıt olarak glikoz alımının kinetik ölçümlerini gerektiren alım mekanizmalarını da değiştirir. Bu makalede, hücre dışı FD-glukoz tükenmesini ölçmek için bir yöntem açıklanmakta ve hücre ve dokularda hücre içi FD-glukoz alımı ile korelasyonunu ex vivo olarak doğrulamaktadır. Hücre dışı glikoz tükenmesi, yüksek verimli kinetik ve doza bağımlı çalışmaların yanı sıra glisemik aktiviteye sahip bileşikleri ve dokuya özgü etkilerini tanımlamak için potansiyel olarak uygulanabilir.
Introduction
Glikoz alımını ölçme talebi, glikoz metabolizmasına bağlı çok sayıda hastalıkta salgın bir artışı ele alma konusundaki kritik ihtiyaçla birlikte artmaktadır. Dejeneratif metabolik hastalıkların altında yatan mekanizmalar, nörolojik ve bilişsel bozukluklar1, enflamatuar2 ve bulaşıcı hastalıklar3, kanser 4,5 ve yaşlanma6, enerji ve depolanması için glikoz metabolizmasına, anabolik süreçlere, proteine ve gen modifikasyonuna, sinyalleşmeye, genlerin düzenlenmesine ve nükleik asitlerin sentezi ve replikasyonuna bağlıdır 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM), glukoz alım regülasyonunun arızalanması ile doğrudan ilişkilidir. DM, tip-1, -2 ve -3 diabetes mellitus, gestasyonel diyabet, gençlerin olgunluk başlangıçlı diyabeti ve bu hastalığın çevresel ve / veya genetik faktörlerin neden olduğu diğer türleri gibi kronik hastalıkların bir spektrumudur. 2016 yılında, diyabetle ilgili ilk DSÖ Küresel raporu, en yaygın DM ile yaşayan yetişkinlerin sayısının 1980’den bu yana neredeyse dört katına çıkarak 422 milyon yetişkine10 ulaştığını ve bu DM hastalarının sayısının son birkaç on yıldır katlanarak arttığını göstermiştir. Sadece 2019 yılında, 1,5 milyon ölüm tahmini doğrudan DM10’dan kaynaklandı. Bu dramatik yükseliş, tip-2 DM’deki artıştan ve aşırı kilolu ve obezite 10 dahil olmak üzere onu yönlendiren koşullardankaynaklanmaktadır. COVID-19 pandemisi, DM’li hastalarda mortalitede genel popülasyona kıyasla iki kat artış olduğunu ortaya koymuştur ve bu da glukoz metabolizmasının immün savunmadaki derin ancak tam olarak anlaşılmamış rolünü düşündürmektedir3. DM, obezite ve diğer hastalıkların önlenmesi, erken teşhisi ve tedavisi, farklı dokular tarafından glikoz alımının ölçümlerinin optimizasyonunu ve glukoz alımını etkileyen çevresel 11, beslenme 12, endokrin13, genetik14 ve epigenetik 15 faktörün tanımlanmasını gerektirir.
Araştırmada, hücre içi ve / veya doku glukoz alımı genellikle floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) in vitro 16,17,18 ve in vivo19 ile ölçülür. FD-glukoz, radyoaktif olarak etiketlenmiş glukoz 20, analitik kütle spektroskopisi analizi 21, metabolomik 22, nükleer manyetik rezonans yöntemleri23 ve pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi (PET/BT)5,24 kullanılarak daha hassas yöntemlere kıyasla tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. FD-glikoz alımından farklı olarak, daha fazla biyolojik materyal gerektiren analitik yöntemler, çok adımlı bir numune hazırlama, pahalı aletler ve karmaşık veri analizini içerebilir. Hücre kültürlerinde FD-glikoz alımının etkili ve ucuz ölçümleri, kavram kanıtı deneylerinde kullanılmıştır ve diğer yöntemlerle doğrulama gerektirebilir.
Glukoz alım çalışmaları için FD-glukoz uygulamasının temeli, endojen glukoz25’e kıyasla FD-glukoz metabolizmasının azalmasıdır. Bununla birlikte, hem endojen glikoz hem de FD-glikoz, anabolik, katabolik ve sinyal süreçlerinde kullanılmak üzere tüm hücresel bölmeler arasında dinamik olarak dağıtılır. FD-glikozun bölümlendirilmesi ve zamana bağlı işlenmesi25 , floresan ölçümlerine müdahale eder ve bu tahlilin yüksek verimli tarama deneyleri, kinetik analiz, 3D hücre kültürü, ko-kültürler ve doku eksplant deneylerinde kullanımı için ana sınırlayıcı faktörleri temsil eder. Burada, FD-glukozun hücre dışı tükenmesi ile hücre içi alımı arasında yüksek bir korelasyon olduğunu gösteren veriler sunuyoruz, bu da FD-glukozun hücre içi glikoz alımı için vekil bir ölçüm olarak hücre dışı tükenmesini düşündürmektedir. Glikozun hücre dışı tükenmesinin ölçümü, insülin ile tedavi edilen farelerde glikoz alımındaki dokuya özgü farklılıkları doğrulamak için ve bu yöntemin bir ilke kanıtı sağlamak için deneysel bir ilaç18 uygulanmıştır.
Mevcut protokol, 3T3-L1 hücrelerinde FD-glukoz alımının hücre içi ve hücre dışı (Şekil 1) ölçümlerini tanımlamaktadır. Protokol bölümleri 1-7, 48 saat boyunca hücrelerin kültürünü ve büyümesini açıklar; hücre açlığı, stimülasyon ve temel hücre dışı ölçümler; ve hücre dışı FD-glukozun stimülasyon sonrası ölçümleri ve FD-glukoz ve proteinin hücre içi ölçümleri. Protokol bölüm 8, başka bir yerde tarif edilen insülin ve amino asit bileşiği 2’nin (AAC2) varlığı ve yokluğunda ob / ob farelerinden diseke edilen dokularda FD-glukozun hücre dışı alımının ex vivo ölçümünü açıklamaktadır18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücre dışı FD-glukoz tükenmesinin hücre kültüründe normalize hücre içi glukoz alımı ile doğrudan karşılaştırılması, hücre dışı glikoz tükenmesinin glikoz alım değerlendirmesi için vekil bir ölçüm olabileceğini düşündüren yüksek bir korelasyon göstermiştir. Hücre dışı FD-glukoz ölçümü çok çeşitli FD glukoz konsantrasyonlarını kullanabilir, ayrıca 0.5-2.5 μg FD-glukoz / mL’nin optimal aralığı sağladığı görülmektedir. Hücre dışı FD-glukoz, hücre içi FD-glu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Proje, Ralph ve Marian Falk Tıbbi Araştırma Katalizörü Ödülü ve Kathleen Kelly Ödülü tarafından desteklendi. Diğer destekler arasında Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi UL1RR025755 ve NCI P30CA16058 (OSUCCC), NIH Tıbbi Araştırma Yol Haritası yer aldı. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezi veya NIH’nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
