Внеклеточное истощение глюкозы как косвенная мера поглощения глюкозы в клетках и тканях Ex Vivo
Summary
Внеклеточное истощение флуоресцентно меченой глюкозы коррелирует с поглощением глюкозы и может быть использовано для высокопроизводительного скрининга поглощения глюкозы в иссеченных органах и клеточных культурах.
Abstract
Продолжающаяся во всем мире эпидемия диабета увеличивает спрос на выявление экологических, пищевых, эндокринных, генетических и эпигенетических факторов, влияющих на поглощение глюкозы. Измерение внутриклеточной флуоресценции является широко используемым методом для проверки поглощения флуоресцентно меченой глюкозы (FD-глюкозы) в клетках in vitro или для визуализации тканей, потребляющих глюкозу in vivo. Этот анализ оценивает поглощение глюкозы в выбранный момент времени. Внутриклеточный анализ предполагает, что метаболизм FD-глюкозы медленнее, чем метаболизм эндогенной глюкозы, которая участвует в катаболических и анаболических реакциях и передаче сигналов. Однако динамический метаболизм глюкозы также изменяет механизмы поглощения, что потребует кинетических измерений поглощения глюкозы в ответ на различные факторы. В данной статье описан метод измерения внеклеточного истощения FD-глюкозы и подтверждена его корреляция с внутриклеточным поглощением FD-глюкозы в клетках и тканях ex vivo. Внеклеточное истощение глюкозы может быть потенциально применимо для высокопроизводительных кинетических и дозозависимых исследований, а также для выявления соединений с гликемической активностью и их тканеспецифическими эффектами.
Introduction
Спрос на измерение поглощения глюкозы растет вместе с острой необходимостью борьбы с эпидемическим ростом множества заболеваний, зависящих от метаболизма глюкозы. Основные механизмы дегенеративных метаболических заболеваний, неврологических и когнитивных расстройств1, воспалительных2 и инфекционных заболеваний3, рака 4,5, а также старения6 зависят от метаболизма глюкозы для получения энергии и ее хранения, анаболических процессов, модификации белка и генов, передачи сигналов, регуляции генов и синтеза и репликации нуклеиновых кислот 7,8,9 . Сахарный диабет (СД) напрямую связан с нарушением регуляции поглощения глюкозы. СД представляет собой спектр хронических заболеваний, таких как сахарный диабет 1 типа, -2 и -3, гестационный диабет, диабет зрелости молодых людей и другие типы этого заболевания, вызванные экологическими и / или генетическими факторами. В 2016 году первый Глобальный доклад ВОЗ о диабете продемонстрировал, что число взрослых, живущих с наиболее распространенным СД, увеличилось почти в четыре раза с 1980 года до 422 миллионов взрослых10, и это число пациентов с СД растет экспоненциально в течение последних нескольких десятилетий. Только в 2019 году, по оценкам, 1,5 миллиона смертей были непосредственно вызваны СД10. Этот резкий всплеск связан с ростом СД 2 типа и условиями, приводящими к нему, включая избыточный вес и ожирение10. Пандемия COVID-19 выявила двукратное увеличение смертности у пациентов с СД по сравнению с населением в целом, что свидетельствует о глубокой, но плохо изученной роли метаболизма глюкозы в иммуннойзащите 3. Профилактика, ранняя диагностика и лечение СД, ожирения и других заболеваний требуют оптимизации измерений поглощения глюкозы различными тканями и выявления факторов окружающей среды11, питания12, эндокриннойсистемы 13, генетической14 и эпигенетической15 факторов, влияющих на поглощение глюкозы.
В исследованиях внутриклеточное и/или тканевое поглощение глюкозы обычно измеряется флуоресцентно меченой глюкозой (FD-глюкоза) in vitro 16,17,18 и in vivo19. FD-глюкоза стала предпочтительным методом по сравнению с более точными методами с использованием радиоактивно меченой глюкозы20, аналитического масс-спектроскопического анализа21, метаболомики22, методов ядерного магнитного резонанса23 и позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ / КТ) 5,24. В отличие от поглощения глюкозы FD, аналитические методы, требующие большего количества биологического материала, могут включать многоступенчатую подготовку образцов, дорогостоящие инструменты и сложный анализ данных. Эффективные и недорогие измерения поглощения FD-глюкозы в клеточных культурах использовались в экспериментах по доказательству концепции и могут потребовать подтверждения другими методами.
Основой применения FD-глюкозы для исследований поглощения глюкозы является сниженный метаболизм FD-глюкозы по сравнению с эндогенной глюкозой25. Тем не менее, как эндогенная глюкоза, так и FD-глюкоза динамически распределяются между всеми клеточными компартментами для использования в анаболических, катаболических и сигнальных процессах. Компартментализация и зависящая от времени обработка25 FD-глюкозы вмешиваются в измерения флуоресценции и представляют собой основные ограничивающие факторы для использования этого анализа в высокопроизводительных скрининговых экспериментах, кинетическом анализе, 3D-культуре клеток, ко-культурах и экспериментах с тканевым эксплантом. Здесь мы приводим данные, демонстрирующие высокую корреляцию между внеклеточным истощением FD-глюкозы и ее внутриклеточным поглощением, предполагая внеклеточное истощение FD-глюкозы в качестве суррогатного измерения внутриклеточного поглощения глюкозы. Измерение внеклеточного истощения глюкозы было применено для подтверждения тканеспецифических различий в поглощении глюкозы у мышей, получавших инсулин и экспериментальный препарат18 , чтобы обеспечить доказательство принципа этого метода.
Текущий протокол описывает внутриклеточные и внеклеточные (рисунок 1) измерения поглощения глюкозы FD в клетках 3T3-L1. Разделы протокола 1-7 объясняют культуру и рост клеток в течение 48 ч; клеточное голодание, стимуляция и базовые внеклеточные измерения; и постстимуляционные измерения внеклеточной FD-глюкозы и внутриклеточные измерения FD-глюкозы и белка. Раздел 8 протокола описывает измерение ex vivo внеклеточного поглощения FD-глюкозы в тканях, рассеченных у мышей ob/ob в присутствии и отсутствии инсулина и аминокислотного соединения 2 (AAC2), описанного в другом месте18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Прямое сравнение внеклеточного истощения FD-глюкозы с нормализованным внутриклеточным поглощением глюкозы в культуре клеток показало высокую корреляцию, предполагая, что внеклеточное истощение глюкозы может быть суррогатным измерением для оценки поглощения глюкозы. Измерение внекл…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проект был поддержан Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst Award и Kathleen Kelly Award. Другие виды поддержки включали Национальный центр исследовательских ресурсов UL1RR025755 и NCI P30CA16058 (OSUCCC), Дорожную карту NIH для медицинских исследований. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не отражает официальную точку зрения Национального центра исследовательских ресурсов или NIH.
Materials
| 3T3-L1 mouse fibroblasts | ATCC | CL-173 | Cell line |
| 96-well plates | Falcon | 353227 | Plastic ware |
| B6.V-Lepob/J male mice | Jackson Laboratory | stock number 000632 | Mice |
| BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | Device |
| Bovine serum | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | Cell culture |
| Calf serum | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | Cell culture |
| Cell incubator | Forma | Series II Water Jacket | Device |
| Diet (mouse/rat diet, irradiated) | Envigo | Teklad LM-485 | Diet |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | Reagent |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | Cell culture |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500mL | Reagent |
| Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose) | Sigma | 72987-1MG | Assay |
| Glucose-free and phenol red-free DMEM | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | Cell culture |
| Human insulin 10 mg/mL | MilliporeSigma, Cat N 91077C | Cat N 91077C | Reagent |
| Isoflurane, 5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | Anestaetic |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | Cell culture |
| Phosphate buffered solution | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | Cell culture |
| Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay | ThermoFisher | Cat N23225 | Assay |
| Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | Assay |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | Cell culture |
References
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568 (2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al. Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).
- Kumar, A., et al. Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis. Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).
- Lee, J. H., et al. Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer. Scientific Reports. 11 (1), 21556 (2021).
- Miner, M. W. G., et al. Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas. Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358 (2021).
- Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging. Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).
- Ebrahimi, A. G., et al. Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability. Molecular Metabolism. 35, 100959 (2020).
- Ruberto, A. A., et al. KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism. Elife. 10, 65574 (2021).
- Stocks, B., Zierath, J. R. Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity. Endocrinology Reviews. , (2021).
- World Health Organization. Global report on diabetes. World Health Organization. , (2016).
- Kolb, H., Martin, S. Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes. BMC Medicine. 15 (1), 131 (2017).
- Galicia-Garcia, U., et al. Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus. International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275 (2020).
- Petrov, M. S., Basina, M. DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas. European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).
- Sirdah, M. M., Reading, N. S. Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes. Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).
- Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition. Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).
- Yamamoto, N., et al. Measurement of glucose uptake in cultured cells. Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).
- Yang, L., et al. A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake. Food Chemistry. 372, 131218 (2021).
- Lee, A., et al. Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice. Biomaterials. 239, 119839 (2020).
- Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis. Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).
- Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study. Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117 (2020).
- Saparbaev, E., et al. Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions. Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).
- Schulz, A., et al. Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity. Scientific Reports. 10 (1), 697 (2020).
- Shulman, R. G. Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects. Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).
- Cochran, B. J., et al. In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes. Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).
- Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog. Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).
- Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture. Journal of Visualized Experiments. (7), e266 (2007).
- DiSilvestro, D. J., et al. Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice. PLoS One. 11 (4), 0153198 (2016).
- Friedman, J. M. Leptin and the endocrine control of energy balance. Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).
- Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), 12317-12321 (1998).
- Guillam, M. T., et al. Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2. Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).
- Barros, L. F., et al. Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes. Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).
- Sprinz, C., et al. Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review. PLoS One. 13 (2), 0193140 (2018).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- de Urquiza, A. M., et al. Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain. Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).
- Olson, A. L., Pessin, J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family. Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).
- Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19. Biomedicines. 8 (11), 460 (2020).
- Ligasova, A., Koberna, K. DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods. Molecules. 26 (18), 5515 (2021).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).
