Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשבר יאטרוגני של פיר עצם הירך של חולדות לבקנים Wistar ומעקב אחר התפתחות היבלת. מודל זה של אוסטאוטומיה של עצם הירך יכול לסייע לחוקרים להעריך את תהליך ריפוי השבר ולחקור כיצד תרופה יכולה להשפיע על ריפוי שברים.
Abstract
ריפוי שברים הוא תהליך פיזיולוגי המביא להתחדשות פגמים בעצמות על ידי פעולה מתואמת של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים. לתרופות אוסטאואנבוליות יש פוטנציאל להגביר את תיקון השברים, אך יש להן אילוצים כמו עלויות גבוהות או תופעות לוואי לא רצויות. פוטנציאל ריפוי העצם של תרופה יכול להיקבע בתחילה על ידי מחקרים במבחנה , אך מחקרי in vivo נדרשים להוכחת ההיתכנות הסופית. מטרתנו הייתה לפתח מודל מכרסם אוסטאוטומיה של עצם הירך שיוכל לסייע לחוקרים להבין את התפתחות היווצרות היבלות בעקבות שבר בפיר עצם הירך, ושיוכל לעזור לקבוע אם לתרופה פוטנציאלית יש תכונות ריפוי עצם. חולדות לבקנים זכרים בוגרים של Wistar שימשו לאחר אישור ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים. המכרסמים הורדמו, ובתנאים אספטיים נוצרו שברים רוחביים שלמים בשליש האמצעי של פירי עצם הירך באמצעות אוסטאוטומיה פתוחה. השברים צומצמו וקובעו פנימית באמצעות חוטי K תוך-מדולריים, וריפוי שברים משני הותר להתרחש. לאחר הניתוח, משככי כאבים intraperitoneal ואנטיביוטיקה ניתנו במשך 5 ימים. צילומי רנטגן שבועיים רציפים העריכו היווצרות יבלות. החולדות הוקרבו על סמך נקודות זמן רדיולוגיות שנקבעו מראש, והתפתחות יבלת השבר נותחה באופן רדיולוגי ובאמצעות אימונוהיסטוכימיה.
Introduction
עצם היא רקמת חיבור צפופה המורכבת מתאים יוצרי עצם, אוסטאובלסטים, ותאים סופגי עצמות, האוסטאוקלסטים. ריפוי שברים הוא תהליך פיזיולוגי המביא להתחדשות פגמים בעצמות על ידי פעולה מתואמת של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים1. כאשר יש שבר, פעילות אוסטאובלסטית ואוסטאוקלסטית באתר השבר הם חלק מהגורמים החשובים הקובעים את ריפוי העצם2. כאשר ריפוי שברים חורג ממסלולו הרגיל, הוא גורם לעיכוב באיחוד, אי-איחוד או אי-איחוד. שבר אמור להיות ב- nonunion כאשר יש כשל של איחוד של השבר במשך 9 חודשים, ללא התקדמות של תיקון ב 3 החודשים האחרונים3. כ-10%-15% מכלל השברים חווים עיכוב בתיקון שעלול להתקדםל-nonunion 4. שיעור אי-האיחוד של כל השברים הוא 5%-10% ומשתנה בהתאם לעצם המעורבת ולאתר השבר5.
המשטר הנוכחי לטיפול בשברים כולל שיטות כירורגיות ו/או רפואיות. נכון לעכשיו, עיכוב או nonunion של שברים ניתן להתגבר על ידי אסטרטגיות כירורגיות כמו השתלת עצם. עם זאת, להשתלת עצם יש מגבלות וסיבוכים כמו זמינות של רקמת השתל, כאבים באתר התורם, תחלואה וזיהום6. הטיפול הרפואי כולל תרופות אוסטאואנאבוליות כמו חלבון מורפוגנטי של העצם (BMP) וטריפראטיד (אנלוגי פאראטמונרלי). לחומרים אוסטאואנבוליים הנמצאים בשימוש כיום יש פוטנציאל להגביר את תיקון השברים אך יש להם אילוצים כמו עלויות מופקעות או תופעות לוואי לא רצויות7. לפיכך, יש מקום לזיהוי חלופות חסכוניות ולא כירורגיות לריפוי עצם. פוטנציאל ריפוי העצם של תרופה יכול להיקבע בתחילה על ידי מחקרים במבחנה , אך מחקרי in vivo נדרשים להוכחת ההיתכנות הסופית. תרופה הידועה כמשפרת את ריפוי העצם צריכה לעבור הערכה במבחנה , ואם היא נמצאת מבטיחה, ניתן להשתמש בה למחקרי מודל של חיות in vivo . אם התרופה תוכיח שהיא מקדמת היווצרות עצם ושיפוץ מחדש במודל in vivo , היא תוכל להמשיך לשלב הבא (כלומר, ניסויים קליניים).
הערכת ריפוי שברים בבעלי חיים היא צעד הגיוני קדימה כדי להעריך סוכן חדש שהוכנס לריפוי עצם לפני שהוא עובר ניסויים בבני אדם. עבור מחקרי מודל בעלי חיים in vivo של ריפוי שברים, מכרסמים הפכו למודל8 פופולרי יותר ויותר. דגמי המכרסמים עוררו עניין הולך וגובר בשל עלויות התפעול הנמוכות, הצורך המוגבל במקום ופחות זמן הדרוש לריפוי עצם9. בנוסף, למכרסמים יש ספקטרום רחב של נוגדנים ומטרות גנטיות, המאפשרים מחקרים על המנגנונים המולקולריים של ריפוי והתחדשות עצם10. ישיבת קונצנזוס הדגישה באופן מקיף מודלים שונים לריפוי עצמות של בעלי חיים קטנים והתמקדה בפרמטרים השונים המשפיעים על ריפוי העצם, כמו גם בדגש על מספר מודלים של שברים ושתלים של בעלי חיים קטנים11.
ניתן לחלק את מודלי השבר הבסיסיים באופן רחב למודלים פתוחים או סגורים. מודלים של שבר סגור משתמשים בכוח כיפוף של שלוש או ארבע נקודות על העצם ואינם דורשים גישה כירורגית קונבנציונלית. הם מובילים לשברים אלכסוניים או ספירליים, הדומים לשברים ארוכים בעצמות בבני אדם, אך היעדר סטנדרטיזציה של מיקום השבר ומממדיו עשוי לשמש גורם מבלבל בהם12. מודלים של שבר פתוח דורשים גישה כירורגית לאוסטאוטומיה של העצם, עוזרים להשיג דפוס שבר עקבי יותר באתר השבר, אך קשורים להחלמה מאוחרת בהשוואה למודלים הסגורים13. הבחירה בעצם המשמשת לחקר ריפוי שברים נותרה בעיקר השוקה ועצם הירך בשל מידותיהם ונגישותם. הבחירה של אתר השבר היא בדרך כלל diaphysis או metaphysis. האזור המטאפיזיאלי נבחר במיוחד במקרים בהם ריפוי שברים נלמד בנושאים אוסטאופורוטיים, שכן המטאפיזה מושפעת יותר מאוסטאופורוזיס14. ניתן להשתמש במספר שתלים כמו פינים תוך-מדולריים וקיבועים חיצוניים כדי לייצב את השבר11,15.
מטרת המחקר הייתה לפתח מודל מכרסמים פשוט וקל למעקב, שיוכל לסייע לחוקרים לא רק להבין את התפתחות היבלת בעקבות שבר בעצם הירך, אלא גם לסייע לקבוע אם לתרופה פוטנציאלית יש תכונות ריפוי עצם על ידי הבנת המנגנון שבאמצעותו היא פועלת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים נעשו לאחר קבלת אישור אתי מהוועדה המוסדית לאתיקה בבעלי חיים (IAEC), AIIMS, ניו דלהי, הודו (286/IAEC-1/2021).
1. הליך טרום ניתוחי
- בית זכר Wistar חולדות לבקנים 6-8 שבועות של גיל, במשקל בין 150-200 גרם כל אחד, במתקן בעלי חיים מרכזי (CAF) בכלובים נפרדים. זה מבטיח שלא תהיה פגיעה באתר הניתוח/שבר כאשר חולדות מרובות חולדות חולקות כלובים.
- יש לשמור על החולדות בטמפרטורה של 23°C ±-2°C בסביבה מבוקרת לחות עם לחות יחסית של 50% ±-5%, לחשוף אותן למחזור חושך/אור של 12 שעות, ולתת גישה למזון (תזונה חצי סינתטית סטנדרטית): דיאטת גלולות (יבשה) ומים. הרכב הדיאטה הסינתטית למחצה הסטנדרטית הוא כדלקמן: קמח גרם בנגלי קלוי (60%), קמח חיטה (22%), קזאין (4%), אבקת חלב רזה (5%), שמן מזוקק (4%), תערובת מלח עם עמילן (4.8%), ותערובת ויטמין כולין עם עמילן (0.2%).
- התאקלמו את החולדות לתקופה של לפחות 48 שעות לפני הניתוח.
- שקלו כל חולדה בסולם שקילה דיגיטלי ושימו לב למשקל.
- מתן זריקות תוך-צפקיות (IP) של צפורוקסים (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף), טרמדול (25 מ"ג/ק"ג משקל גוף) ושילוב של קטמין (75 מ"ג/ק"ג משקל גוף) עם קסילזין (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) לחולדות 15 דקות לפני תחילת ההליך הכירורגי. יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים כדי למנוע יובש בעין.
- יש להסיר את השיער מהגפה התחתונה הימנית, מאזור האגף ועד למפרק הברך, עם מריחה חיצונית של קרם להסרת שיער.
הערה: ניתן לאסוף דם (0.5 מ"ל) מווריד הזנב של כל חולדה לצורך ניתוח בסיסי של פרמטרים שונים. ניתן לאסוף דם שוב כל שבועיים לאחר הניתוח.
2. הליך כירורגי ליצירת שבר רוחבי מלא באמצעות אוסטאוטומיה פתוחה
הערה: השתמש בחדר ניתוח ייעודי עם שולחן ניתוחים וטמפרטורת סביבה אופטימלית (26°C) לביצוע ההליך.
- מניחים את גוש השעווה (מגש אלומיניום 30 ס"מ על 30 ס"מ על 4 ס"מ המכיל שעווה עד עומק של 2.5 ס"מ) על שולחן הניתוחים ומכסים אותו בווילונות סטריליים. בלוק השעווה מונע כל שינוי בתנוחת החיה במהלך הניתוח.
- אשר את תחילת ההרדמה (על ידי בדיקת אובדן צביטה בבוהן). מניחים את החולדה המורדמת על וילון סטרילי במצב צדדי שמאלי. בקשו מעוזר להחזיק את הגפה התחתונה הימנית (ברך וירך) בהארכה. שמור על תמיכה קשה סטרילית (גוש שיש) מתחת לרגל ימין כדי לתמוך בעצם הירך. נקה את האתר הכירורגי עם אלכוהול ובטאדין.
- להזריק הרדמה מקומית (0.25 מ"ל של 1% ליגנוקאין) באתר החתך (היבט צדדי של ירך ימין), לחתוך חור בווילון סטרילי אחר, ולחשוף רק את רגל ימין של החולדה דרכו לניתוח.
- יש לתת חתך עור אנכי של 1 ס"מ בצד הצדדי של ירך ימין, ולהאריך אותו לפי הצורך עם להב כירורגי מס' 15.
- חשוף את שריר הווסטוס לטרליס על ידי הפרדת החיתולית העמוקה באמצעות מספריים של מצנבאום. פיצול vastus lateralis בקנה אחד עם סיבי השריר באמצעות מלקחיים עורקים עד פיר של עצם הירך הוא הגיע.
- שחררו את העצם מהשרירים המחוברים אליה באמצעות המעלית הפריוסטאלית.
- להזריק הרדמה מקומית (0.2 מ"ל של 1% ליגנוקאין) בתוך ומסביב לפריוסטאום כדי למנוע רפלקס vasovagal.
- צור כניסה בשליש האמצעי של פיר עצם הירך באמצעות להב כירורגי מספר 15, ושבר את העצם בשליש האמצעי של הפיר (שבר שלם) על ידי הנחת אזמל על הכניסה שנעשתה (כך שהאזמל לא יחליק) והקשה עדינה על האזמל עם פטיש. השתמש בתמיכה הקשה הסטרילית (גוש שיש) כדי לתמוך בעצם תוך כדי שבירתה כדי להבטיח שבר נקי.
הערה: התמיכה הקשה הסטרילית בדרך כלל אינה גורמת לפגיעה משמעותית בשרירים שמתחת. - לתקן את השבר באופן פנימי באמצעות חוט K סטרילי (1.0 מ"מ) המוחזק בעזרת מקדחה כוח המופעלת על ידי סוללה. מעבירים את חוט ה- K לתעלה המדולרית של השבר הדיסטלי דרך אתר השבר. לאחר מכן, קדחו את חוט ה-K דרך הקצה הדיסטלי של עצם הירך באמצעות מקדח הכוח המופעל באמצעות הסוללה.
הערה: יש לחטא את פני השטח של מקדחת החשמל באלכוהול לפני השימוש. החלף כפפות לאחר תיקון חוט K. - לאחר הפחתת השבר, לקדם את חוט K מן הקצה הדיסטלי לתוך התעלה של שבר פרוקסימלי עד שהוא מקבל רכישה באזור trochanteric. חותכים את החלק הדיסטלי של חוט K הבולט דרך העור באמצעות חותך חוטים.
- כופפו את קצה חוט ה-K לכ-90° באמצעות צבתות והשתמשו בתחבושת גזה ספוגה בבטאדין לחבישת סיכות. חוט K פועל כמו סד intramedullary לשמירה על השבר במצב מופחת.
- הקפידו על המוסטזיס מלא לפני סגירת העור באמצעות תפר ניילון 3-0. הפעל לחץ על אזור הדימום באמצעות גזה סטרילית או מלקחיים עורקים כדי לעצור כל דימום.
- נקה את הפצע עם betadine, ולכסות אותו עם גזה סטרילית סרט דבק micropore.
3. טיפול לאחר הניתוח
- להחזיר את החולדות לכלובים שלהן, לאפשר אמביציה רגילה, ולהמשיך לתת דיאטה חצי סינתטית סטנדרטית עד להקריב אותם, כמו גם אנטיביוטיקה (הזרקת cefuroxime 100 מ"ג / ק"ג) ומשככי כאבים (הזרקת טרמדול 25 מ"ג / ק"ג / יום בשתי מנות מחולקות) intraperitoneally במשך 5 ימים לאחר ההליך.
הערה: ניתן לחלק את החולדות לקבוצות טיפול וביקורת כדי לבדוק תרופה מסוימת. אם התרופה מסיסה במים, ניתן לתת אותה דרך הפה באמצעות gavage. ניתן לציין את משקלם של בעלי החיים הבודדים כדי לחשב את מינון התרופה לשימוש. ניתן לעקוב אחר קריטריוני הכללה והדרה כדי להבטיח הומוגניות של קבוצות בעלי החיים. - לשכן את בעלי החיים בכלובים בודדים בתנאים דומים לתקופה שלפני הניתוח. בדוק את האתר כירורגי כל יום כדי לחפש סימנים של כאב לאחר הניתוח, זיהום פצע, החלקה של תפרים, או כל נפיחות בבטן או אי נוחות.
- להעריך את ריפוי העצם על ידי צילום רנטגן של האתר השבור פעם בשבוע.
4. הליך רדיולוגי
- לפני צילום הרנטגן, מרדימים את החולדות בזריקה תוך-צפקית של קטמין (50 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
- שמור על מפרק הירך של החולדה במצב מכופף וחטוף בעוד מפרק הברך נשמר חצי מכופף כדי לקחת את צילום הרנטגן של האיבר השבור עם הגדרות החשיפה הבאות: Ref. kVp ≈ 62; Ref. mAS = 6.4; והגדרות חשיפה אוטומטיות (Ref. mA=160).
הערה: צילומי רנטגן נלקחו בנקודת ההתחלה (יום אחד לאחר הניתוח) ולאחר מכן פעם בשבוע עד להקרבה או 5 שבועות.
5. המתת חסד של בעלי חיים ושליפת יבלות
- הקריבו את החולדות על ידי מנת יתר של פחמן דו חמצני (מתן 100% CO2 בקצב זרימה של 7-8 ליטר לדקה למשך דקה אחת, ולאחר מכן תקופת המתנה של 4-5 דקות), בשתי נקודות זמן שנקבעו קודם לכן, בהתבסס על המראה הרדיולוגי של יבלות גישור רכות וקשות, בהתאמה.
- חותכים את העור במקביל לעצם הירך ומפרידים בזהירות את השרירים העליונים כדי למנוע נזק לרקמת היבלת.
- שבר את העצם בין מפרק הירך לרקמת היבלת באמצעות פטיש ואזמל. באופן דומה, שברו את העצם בין היבלת למפרק הברך. הסר את חוט K ונקה את חתיכת העצם במלח כדי להסיר קרישי דם ורקמות רכות.
- מעבירים את היבלת מיד למיכל עם 10% פורמלין נאגר ניטרלי (20 מ"ל לדגימה) ושומרים אותו למשך 3 ימים בטמפרטורת החדר (RT).
6. Decalcification של רקמת העצם והיבלות
- קח את רקמת היבלת מפורמלין ושמור אותה ב- RT בתמיסת ETDA של 20%, pH 7, לצורך פירוק רקמת העצם.
- החלף תמיסת EDTA טרייה כל יומיים במשך כ -3 שבועות, ובדוק את פירוק העצם על ידי ניקוב העצם עם מחט מבלי להפריע לרקמת היקולוס. decalcification אופטימלי מסומן על ידי אובדן של תחושה מחוספסת נורמלית של רקמת העצם.
- לאחר decalcification מלא, לחתוך את החלק sagittal של היבלת ולהכין בלוקים פרפין של רקמת יבלת. חותכים קטעים בעובי 4 מיקרומטר של רקמת היבלת להיסטופתולוגיה16 וכל ניתוח השוואתי אחר17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מחקר זה נערך כדי לפתח מודל של אוסטאוטומיה של עצם הירך בחולדות לבקנים של Wistar. מודל זה יכול לשמש להערכת ריפוי עצם, כמו גם את ההשפעה האוסטאוגנית של תרופה אוסטאואנאבולית מבטיחה בריפוי עצם. אמצעי זהירות ופרוטוקולים כירורגיים סטנדרטיים ננקטו. חלוקים סטריליים, וילונות וציוד כירורגי שימשו להליך (איור 1). הציוד (טבלה 1) עוקר 48 שעות לפני הניתוח. חומרי הרדמה, משככי כאבים ואנטיביוטיקה שימשו בהתאם לפרוטוקול כדי להבטיח שבעלי החיים יישארו נקיים מכאבים וזיהומים בכל עת. ניתן לאסוף דם (0.5 מ"ל) מווריד הזנב של כל חולדה לצורך ניתוח בסיסי ומעקב השוואתי כרונולוגי רציף של פרמטרים שונים עם התרחשות ריפוי השבר. השיער הוסר מאזור האגף לאזור הברך באמצעות קרם להסרת שיער (איור 2). הליך האוסטאוטומיה ארך כ-10 דקות (מהחתך הראשון ועד לתפר). זיהום ותמותה היו זניחים על נקיטת אמצעי זהירות אספטיים. חתך נעשה לאחר הרדמה מקומית (lignocaine), ופיר עצם הירך נחשף לאחר נסיגה של סיבי הווסטוס לטראליס (איור 3). כניסה (חריץ) נוצרה בעצם באמצעות להב כירורגי כדי להבטיח שהאזמל לא יחליק. תמיכה סטרילית קשה (גוש שיש) שימשה לתמיכה בעצם בזמן שבירתה כדי להבטיח שבר נקי (איור 1). שבר רוחבי שלם נגרם בשליש האמצעי של פיר עצם הירך באמצעות אזמל ופטיש (איור 4).
השבר היה מקובע פנימית באמצעות חוט K סטרילי (1.0 מ"מ). חוט K הועבר לתעלה המדולרית של השבר הדיסטלי דרך אתר השבר. חוט ה-K נקדח החוצה דרך הקצה הדיסטלי של עצם הירך. השבר הופחת, ואז חוט K התקדם מהקצה הדיסטלי לתעלה של השבר הפרוקסימלי עד שהוא השיג רכישה באזור הטרוכנטרי. החלק הדיסטלי של חוט K שבלט דרך העור נחתך. חוט ה-K פעל כסד תוך-מדלי כדי לשמור על השבר במצב מופחת (איור 5).
צילום רנטגן של האזור השבור נעשה יום אחד לאחר הניתוח ושבוע לאחר מכן כדי להעריך את מראה היבלת (תחילת ריפוי השבר) ואת המראה של יבלת הגישור (נקודת הזמן הראשונה שבה נרפא פער השבר), כפי שהוערך על ידי הרדיולוג (איור 6). שתי נקודות זמן רדיולוגיות להערכה השוואתית של ריפוי שברים היו המראה (הדמיה) של היבלת (הרכה) והופעת יבלת הגישור (הקשה).
לאחר ההקרבה, עצם הירך נשמרה בקפידה בפורמלין, ולאחר מכן בפרוטוקול לפירוק עצם (איור 7). חוט ה-K הוסר במהלך ההקרבה, תוך הקפדה שלא להפריע ליבל. לאחר פירוק מלא, העצם נחתכה למקטעים סגיטליים ונשמרה בגושי פרפין לחיתוך (חתכים בעובי 4 מיקרומטר) לפי הצורך. מקטע מוכתם בהמטוקסילין ובאאוזין של אתר השבר והיבלות אישר את הסחוס ואת היווצרות העצם החדשה בתום 5 שבועות (איור 8).
איור 1: כלי ניתוח סטריליים המוחזקים על וילון הניתוח על שולחן הניתוחים. המנתח מוכן להתחיל את ההליך הכירורגי בסביבה סטרילית עם מכשירים סטריליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: חולדה מורדמת נשארת על שולחן הניתוחים. לאחר מתן הרדמה לחולדה והסרת השיער סביב אתר החתך, הוא נשמר על שולחן הניתוחים במצב צדדי שמאלי, וחושף את רגל ימין לאוסטאוטומיה. וילון כירורגי נוסף משמש להעברת רגל ימין דרך חור באותו וילון כדי להבטיח שרק הרגל חשופה, ובכך למזער זיהומים בפצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הליך כירורגי: חשיפת הפיר של עצם הירך של החולדה. במהלך אוסטאוטומיה, לאחר חשיפת vastus lateralis, הוא מפוצל בקו אחד עם סיבי השריר כדי לחשוף את פיר עצם הירך. העצם משתחררת מהשרירים המחוברים באמצעות המעלית הפריוסטאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: יצירת אוסטאוטומיה רוחבית שלמה בשליש האמצעי של פיר עצם הירך באמצעות אזמל ופטיש. שבר רוחבי שלם נוצר באמצע שליש מהפיר של עצם הירך על ידי הקשה עדינה על האזמל עם הפטיש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: חוט K פועל כסד תוך-מדלי לשמירה על השבר במצב מופחת. חוט K מועבר לתעלה המדולרית של השבר הדיסטלי דרך אתר השבר. חוט K נקדח החוצה דרך הקצה הדיסטלי של עצם הירך. השבר מצטמצם ואז חוט K מתקדם מהקצה הדיסטלי לתעלה של השבר הפרוקסימלי עד שהוא השיג רכישה באזור הטרוכנטרי. זה נעשה באמצעות מקדחה כוח המופעלת על ידי סוללה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: צילום רנטגן של עצם הירך של החולדה עם חוט K באתרו . (A) לפני גרימת השבר ו-(B) יום אחד לאחר הניתוח. ריפוי השבר מנוטר באופן רדיולוגי על ידי ביצוע צילומי רנטגן שבועיים רציפים של האתר המנותח כדי להעריך באופן רדיולוגי היווצרות יבלות. השבר נשאר מופחת ומשותק עם חוט K intramedullary. הנתונים המייצגים לפני ואחרי אינם מאותה חיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: עצם עם יבלת (לאחר פירוק אופטימלי) שהושגה לאחר הקרבת החיה בנקודת זמן שנקבעה מראש. (A) יבלת שלמה; (B) קטע סגיטלי של היבל. לאחר הקרבת החיה, האזור של אתר השבר מתקבל, נשמר, ו decalcified באמצעות המתודולוגיה המתוארת. היבלת מוערכת לסירוגין כדי להבטיח דה-קלקציה אופטימלית לפני הערכתה על ידי כל טכניקה אחרת (סולם ייחוס בסנטימטרים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: חתך מוכתם בהמטוקסילין ובאוזין באתר השבר מראה יבלת קשה עם היווצרות סחוס ועצם חדשה. (A) הגדלה נמוכה; (B) הגדלה גבוהה. החלקים המוכתמים בהמטוקסילין ובאוזין באתר השבר מראים יבלת קשה עם היווצרות סחוס (חיצים שחורים) ועצם חדשה (חיצים צהובים) (A: 40x; ב: פי 100). החץ הכחול מראה את קצה השבר של העצם, והחץ האדום מראה את האזור השני בקליפת המוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מתארת בבהירות את הפרטים הדרושים לפיתוח מודל אוסטאוטומיה של שבר בחולדות לבקנים של Wistar. מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעה האוסטאוגנית של תרופה אוסטאואנבולית מבטיחה בריפוי שברים, כמו גם להבין את המורכבות של ריפוי עצם. התכונה הבולטת של שיטה זו היא שהיא פשוטה ואינה זקוקה ליותר מדי זמן או ציוד מתוחכם. בשיטה זו נבחרו חולדות הלבקנים הזכרים הבוגרים של Wistar כמודל המכרסמים לניסויים. מין אחיד נבחר כדי להסיר כל גורם מבלבל על ריפוי העצם הקשור להורמוני המין.
מחקר זה עקב אחר ההליך של אוסטאוטומיה פתוחה, הדומה לזה של קבוצות אחרות, כמו גם מודלים אחרים של בעלי חיים קטנים11,18,19. היתרון של האוסטאוטומיה הפתוחה הנהוגה בשיטה זו על פני מודלים אחרים של ריפוי עצם הוא שהפגיעה הנגרמת (שבר עצם קליפת המוח השלם) דומה לשבר עצם ארוך רגיל, וריפוי השבר בשיטה זו דומה לזה של שבר רגיל, שבו יש ריפוי עצם משני (אוסיפיקציה אנצ'ונדרלית) על ידי היווצרות יבלות, לעומת פגיעה בעצם חור קידוח, כאשר יש ריפוי עצם ראשוני (ossification intramembranous)20. השיטה של אוסטאוטומיה פתוחה עדיפה גם על אוסטאוטומיה סגורה או שיטת גרימת לחץ תלת-נקודתית, שבה קיימת אפשרות לשבירת עצם ופער רחב בקו השבר, מה שמוביל להבדל בריפוי השבר21. אוסטאוטומיה פתוחה מגדילה את הסיכוי לזיהום פצעים בהשוואה לאוסטאוטומיה סגורה, אך בדומה למחקרים אחרים, ראינו כי עם אמצעי זהירות נאותים, זיהום פצעים היה זניח22. כמו כן נצפתה במתודולוגיה זו כי יצירת חריץ (כניסה) על העצם עם להב לפני שבירת אותו עם אזמל ופטיש שימש ליצירת קו שבר אחיד ונמנע החלקה של האזמל על העצם. שינוי נוסף שהכנסנו בשיטה זו היה שמירה על גוש קשיח וסטרילי מתחת לעצם לשבר. זה לא רק סיפק כוח נגדי בעת יצירת השבר, אלא גם עזר למנוע התנפצות, ריסוק או קו שבר לא סדיר. זה בדרך כלל לא גורם לפגיעה משמעותית בשרירים שמתחת.
המחקר שלנו השתמש בקרני רנטגן כדי לקבוע את נקודות הזמן של ההקרבה בהתבסס על המראה הרדיולוגי של היבלת כנקודת הזמן הראשונה ועל הופעת יבלת הגישור (הקשה) כנקודת הזמן השנייה בבעלי החיים לפני תחילת הניסוי המלא. יש להקריב את כל קבוצת בעלי החיים ההשוואתית כאשר כל קבוצת טיפול או קבוצת ביקורת מגיעה לנקודת זמן מסוימת כדי להשוות את היבלות שלהם באמצעות ניתוח אימונוהיסטוכימי של סמנים אוסטאובלסטיים ואוסטאוקלסטיים. זה יבטיח השוואה בלתי משוחדת בין קבוצות הטיפול והביקורת השונות. צילום רנטגן של האתר השבור של החולדות צריך להיעשות במרווחים שבועיים, ודגימות דם (וריד זנב) יש לקחת במרווחים שבועיים עד שהם מגיעים לנקודות הזמן המתאימות של הקרבה. צילומי רנטגן שבועיים נעשו (תחת הרדמה) כדי להעריך את היווצרות היבלות על ידי הרדיולוג (שהיה עיוור לקבוצות הביקורת והטיפול). צילומי הרנטגן גם סייעו לבסס ולאשש את הפרמטרים הביולוגיים של ריפוי העצם.
שיטה זו כוללת יישום של חוט K כמו סד intramedullary כדי לשמור על השבר משותק במצב מופחת. עם זאת, קיבוע פין תוך-מדולרי אינו מספק יציבות מוחלטת לשבר, כמו גם ציפוי וקיבועים חיצוניים, ולעתים עשוי להיות קשור לסיבוכים כמו זיהום פצע, נדידת פינים, ניקוב קליפת פיר הירך וכו '. המחקר שלנו גם מציע שעדיף להזריק לינוקאין בתוך ומסביב לפריוסטאום, שהוא רגיש מאוד לכאב. זה מונע כאב חמור ואת האפשרות של הלם נוירוגני במהלך osteotomy. כמו כן, נצפה כי שמירה על נפח זריקות תוך-צפקיות נמוך סייעה למזער את המצוקה הנשימתית שלאחר מכן בחולדות. משככי כאבים ואנטיביוטיקה נמשכו במשך 5 ימים לאחר הניתוח כדי למנוע כל כאב או זיהום. לצורך מחקר זה, עצם הירך נבחרה לגרימת שבר מכיוון שהיא קלה לגישה, קלה לשבירה נקייה, ובגלל קווי המתאר הישרים שלה, שהיא קלה יותר להחדרת חוט K. יש לנקוט משנה זהירות כאשר חוט ה- K מתקדם לתוך השבר הפרוקסימלי של עצם הירך, שכן קיים סיכון לדימום על ידי פגיעה בעורק הירך. נצפה כי חולדות נוטות למשוך את חוט K אם יותר מדי חוט שיורי נשאר בולט מתוך העור.
הפרמטרים של תוצאות ריפוי העצם הם סמנים אוסטאובלסטיים ואוסטאוקלסטיים בדם ובקלאוס של בעלי החיים (מקבוצות שונות ונקודות זמן שונות). עבור סמנים אוסטאובלסטיים ניתן לבחור אוסטיאוקלצין, Col1A1, RANKL, P1NP ופוספטאז אלקליין ספציפי לעצם, בעוד שניתן להעריך CTX ו- RANK כדי להעריך את הפעילות האוסטאוקלסטית. חלק מהפרמטרים הללו ניתן להעריך בסרום, בעוד שאחרים יכולים להיות מוערכים על ידי אימונוהיסטוכימיה ברקמת יבלת. פרמטרים אלה נותנים מבט הוליסטי על שיפוץ עצם על ידי הערכה בו זמנית של פעילות אוסטאובלסטית ואוסטאוקלסטית.
המגבלה של מחקר זה היא שהוא אינו מעריך את חוזק המתיחה של היבלת. באופן אידיאלי, מחקרים ביומכניים מוסיפים ערך לנתונים. יש לנקוט משנה זהירות בעת עיבוד היבלת ורקמת העצם הסמוכה לצורך פירוק, שכן דה-סידן לא שלם לא ייתן תוצאות אופטימליות באימונוהיסטוכימיה.
פרוטוקול זה להערכת ריפוי שברים באמצעות מודל המכרסמים יהיה שימושי עבור כל הקבוצות המנסות להעריך תרופות מבטיחות עם פעילות אוסטאואנבולית. זהו מודל פשוט להערכה מדויקת של ריפוי עצם ושברים במודל המכרסמים תוך הערכת פעילות אוסטאובלסטית ואוסטאוקלסטית ושיפוץ עצם, המעניקים תובנות מכניסטיות שימושיות. אם משאבים ולוגיסטיקה סובבים סביב מספר בעלי החיים מותרים, אינדיקטורים ביולוגיים יכולים גם להיות מחוזקים על ידי הערכה רדיולוגית של ריפוי שבר, כמו גם השוואת חוזק מתיחה, אשר מעריך את קומתו המכנית של העצם שנרפאה. מחקרים המבהירים את מנגנון הפעולה עדיפים על פני מחקרים תצפיתיים גרידא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים או גילויים כספיים אחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות למועצה המרכזית למחקר בהומאופתיה (CCRH), משרד איו"ש, ממשלת הודו, על מימון המחקר. המחברים מודים על העזרה והתמיכה של מתקן החיות המרכזי, AIIMS, ניו דלהי, על עזרתם ותמיכתם בניסויים בבעלי חיים ו- CMET, AIIMS, ניו דלהי, על עזרתם ותמיכתם בצילום ווידאוגרפיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W.
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. Sioud, M. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 5 Suppl 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
