Summary
이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 절편의 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 항체가 부족한 경우 제브라피쉬에서 두 유전자의 발현 패턴을 감지하는 것이 유용합니다.
Abstract
척추 동물로서 제브라 피쉬는 생물학적 연구에 널리 사용되었습니다. 제브라피쉬와 인간은 높은 유전적 상동성을 공유하여 인간 질병의 모델로 사용할 수 있습니다. 유전자 기능 연구는 유전자 발현 패턴의 검출을 기반으로 합니다. 면역조직화학은 단백질 발현을 분석하는 강력한 방법을 제공하지만, 제브라피쉬에서 상업적으로 이용 가능한 항체의 수가 제한되어 있어 코스테인의 적용이 제한됩니다. 제브라피쉬 배아에서 mRNA 발현을 검출하기 위해 제자리 하이브리드화( in situ hybridization)가 널리 사용됩니다. 이 프로토콜은 제브라피쉬 배아 섹션에 대한 현장 혼성화와 면역조직화학을 결합하여 이미지를 얻는 방법을 설명합니다. 저온 절개 전에 제자리 하이브리드화를 수행한 후 항체 염색을 수행했습니다. 면역조직화학 및 단일 cryosection의 이미징은 in situ hybridization 후에 수행되었습니다. 이 프로토콜은 먼저 현장 전사체 검출에 의해 두 유전자의 발현 패턴을 밝히는 데 도움이 되며, 그 다음에는 동일한 섹션의 단백질에 대한 면역조직화학에 의해 도움이 됩니다.
Introduction
제브라피쉬는 발달 및 유전학 연구를 위한 강력한 척추동물 모델입니다 1,2. 제브라피쉬와 인간은 높은 유전적 상동성(유전자의 70%가 인간 게놈과 공유됨)을 공유하여 인간 질병의 모델로 사용할 수 있습니다3. 제브라피쉬에서는 두 유전자의 발현 패턴과 공간적 관계를 감지하는 것이 일반적입니다. 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 1941년에 FITC 표지 항체를 적용하여 감염된 조직에서 병원체를 검출하기 위해 처음 사용되었다4. 조직 섹션의 표적 단백질은 먼저 1차 항체로 표지되고, 그 다음에는 1차 항체의 숙주 종인 면역글로불린에 대한 2차 항체로 표지됩니다. 항체 염색은 단백질의 국소화를 검출하는 강력한 접근 방식으로, 세포 내 수준에서 높은 광학 분해능을 제공합니다. 그러나 제브라피쉬에서 사용할 수 있는 항체의 수는 매우 제한적입니다. 최근 연구에 따르면 약 112,000 개의 항체가 생쥐에 상업적으로 이용 가능합니다. 그러나 Zebrafish5에서 신뢰할 수 있는 것으로 입증된 항체는 거의 없습니다.
대신, 제브라피쉬에서 in situ 하이브리드화는 유전자 발현 패턴 분석에 널리 적용되었습니다. 이 방법은 1980년대초파리 배아의 유전자 발현을 평가하기 위해 처음 사용되었으며, 6,7, 그 이후로 이 기술은 지속적으로 개발되고 개선되었습니다. 초기에, 방사성 표지 DNA 프로브는 mRNA 전사체를 검출하기 위해 사용되었다; 그러나 공간 해상도는 상대적으로 낮았고 방사능으로 인한 잠재적인 건강 위험이 있었습니다. 그 후, 현장 하이브리드화는 디곡시제닌(DIG) 또는 플루오레세인(Fluo)으로 표지된 RNA 프로브에 의존하며, 이는 알칼리성 포스파타제(AP)에 접합되거나 형광 티라마이드 신호 증폭(TSA)에 의해 검출됩니다8,9. TSA가 2개 또는 3개의 유전자를 검출하는 데 사용되었지만 RNA 프로브의 DIG 라벨링 및 antiDIG AP 접합 항체는 여전히 고감도, 안정적이며 현장 혼성화를 위해 널리 사용되는 접근 방식입니다. 따라서 DIG 표지된 in situ 프로브와 결합된 상용화된 항체는 단백질 국소화 및 한 유전자의 발현에 대한 통찰력을 제공하는 데 유용합니다.
전체 마운트 배아는 낮은 광학 해상도로 인해 유전자 간의 공간적 관계를 밝힐 수 없지만, 제브라피쉬 배아는 작고 투명합니다10. 따라서 세포 내 수준에서 유전자의 발현 패턴을 분석하기 위해서는 절편이 필요합니다. Cryosectioning은 수행하기 쉽고 항원을 효과적으로 보존할 수 있기 때문에 제브라피쉬에서 널리 사용되었습니다. 따라서 제브라피쉬 냉동절편의 면역조직화학과 결합된 현장 혼성화는 두 유전자의 발현 패턴을 분석하는 강력한 방법을 제공합니다. 제브라피쉬11에 제자리 혼성화와 면역조직화학의 조합이 적용되었습니다. 그러나, 프로테이나제 K 처리는 항원 완전성을 희생시키면서 프로브 침투를 향상시키기 위해 사용되었다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 이 프로토콜은 항원 회수를 유도하기 위해 가열을 사용한다. 이 프로토콜은 다양한 두께의 다른 단계 및 조직 절편(14μm 머리 절편 및 20μm 척수 절편)의 배아에 적용할 수 있을 뿐만 아니라 두부와 척수를 포함한 두 기관에서 발현되는 유전자를 사용하여 검증되었습니다.
이 기사에서는 cryosections에서 제브라피쉬 배아에서 in situ hybridization과 항체 염색을 결합하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 다양성은 두 개의 서로 다른 뉴런에 대한 in situ 하이브리드화 프로브를 포함하여 다수의 in situ 하이브리드 화-면역조직화학 조합을 사용하여 입증됩니다. 이 방법은 서로 다른 영역과 다른 연령의 배아에서 mRNA와 단백질을 검출하는 데 적합하며 두 유전자의 발현 패턴을 검출하는 데 적합합니다.
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Protocol
모든 동물 프로토콜은 난퉁 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(No. S20191210-402)의 승인을 받았습니다.
1. 제브라 피쉬 배아 수집
- 알을 채취하기 전날 밤에 번식 탱크에 한 쌍의 제브라피쉬를 설치하는데, 하나는 형질전환 제브라피쉬이고 다른 하나는 AB 야생형 제브라피쉬(Tg (foxP2:egfp-caax) X AB 야생형 또는 Tg (hb9:egfp) X AB 야생형)(재료 표 참조). 대각선 플라스틱 칸막이를 사용하여 남성과 여성을 분리하여 물리적 접근을 차단하십시오. 다음날 사육 탱크의 상부를 깨끗한 물로 채워진 깨끗한 하부에 끼우고 사육 탱크의 칸막이를 제거합니다. 물고기 짝짓기를 10-20분 동안 그대로 두고 번식 탱크 바닥에 가라앉은 알을 모으십시오.
- 28.5°C에서 메틸렌 블루(1L의 E3 배아 배지에 0.05% 메틸렌 블루 1mL)를 함유하는 E3 배아 배지( 재료 표 참조)에서 배아를 배양합니다.
- 수정 후 24시간(hpf)의 배아를 페닐티오우레아(PTU, 재료 표 참조)로 처리하여 색소 형성을 방지합니다.
참고: 남녀 동물이 실험에 사용됩니다.
2. 현장 하이브리드화
알림: 2.1-2.11단계에 사용된 물은 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리수입니다( 재료 표 참조).
- ~10개의 배아를 0.5-1mL의 신선한 4% 파라포름알데히드(PFA, 재료 표 참조)로 1.5mL 미세분리기 튜브에 4°C에서 하룻밤 동안 12-14시간 동안 고정합니다.
참고: 계내 혼성화를 위한 프로토콜은 이전에 발표된 문헌12에서 약간 수정되었습니다. PFA는 사용 후 1주일 이내에 또는 -20°C에서 1개월 동안 신선하게 준비하여 4°C에서 보관해야 합니다. 계내 하이브리드화의 모든 다음 단계는 1.5mL 마이크로소지 튜브를 사용하여 수행되었습니다. - 핀셋을 사용하여 48hpf보다 오래된 배아의 피부만 제거합니다.
참고: 48hpf보다 오래된 배아의 몸통 영역으로 RNA 프로브가 침투하는 것을 촉진하기 위해 피부를 제거합니다. - 실온에서 각각 5분 동안 0.1% Tween-20을 함유하는 1x 인산염 완충 식염수(PBST, 재료 표 참조)에서 25%, 50% 및 75% 메탄올로 세척하여 배아를 점진적으로 탈수시킵니다. 이어서, 실온에서 100% 메탄올로 5분 동안 배아를 세척한다. 배아를 -20°C에서 100% 메탄올에서 적어도 12-14시간 동안 하룻밤 동안 배양합니다.
참고: 탈수된 배아는 -20°C에서 100% 메탄올에 6개월 동안 보관할 수 있습니다. - 실온에서 각각 5분 동안 PBST에서 75%, 50% 및 25% 메탄올로 연속적으로 세척하여 배아를 점진적으로 재수화합니다. 배아를 실온에서 각각 5분 동안 PBST로 3회 세척한다.
- 실온에서 PBST에서 10μg/mL proteinase K( 재료 표 참조)로 배아를 분해합니다( 표 1 참조).
- 배아를 PBST로 5분 동안 세척합니다. 이 세척 단계를 세 번 수행하십시오.
- 세척된 배아를 실온에서 15분 동안 4% PFA에 다시 고정합니다.
참고: 이 단계는 PFA가 프로테이나제 K를 비활성화하기 때문에 소화를 중지합니다. 샘플이 부드럽게 혼합되어 모든 배아가 PFA에 노출되도록 합니다. 튜브를 측면에 배치하여 용액에 배아를 고르게 분배할 수 있습니다. 이 PFA는 신선할 필요가 없습니다(최대 2주 동안 냉장 보관할 수 있음). - 배아를 PBST로 세 번 세척하고 각 세척 동안 5분 동안 배양합니다.
- 65°C에서 5분 동안 프리하이브리드화 용액(preHYB, 재료 표 참조)과 함께 배양하여 배아의 프리하이브리드화를 수행합니다. preHYB를 하이브리드화 용액(HYB, 재료 표 참조)으로 교체하고 HYB에서 최소 4시간 동안 프리하이브리드화합니다.
알림: 사전 혼성화를 진행하기 전에 용액을 65°C로 예열합니다. 포름 아미드 ( 재료 표 참조)는 조직의 모양과 구조를 유지하는 데 사용됩니다. 포름아미드는 또한 저온에서 비상동 단편의 결합을 방지합니다. - 배아에 추가하기 전에 HYB에서 프로브(Insm1a 또는 5-HT2C)를 95°C에서 5분 동안 가열합니다. 1μg/mL HYB에서 프로브를 사용하십시오. 배아가 공기와 접촉하지 않도록 가능한 한 많은 preHYB를 제거하고 HYB의 예열 프로브를 배아가 들어 있는 튜브에 추가합니다.
참고: 표지된 RNA 프로브를 사용하여 배아의 표적 mRNA 서열과 혼성화할 수 있습니다. 따라서, 상기 프로브는 관심 유전자의 발현 및 mRNA의 위치를 검출하는데 사용될 수 있다. - 프로브가 50-70°C에서 하룻밤(12-14시간) 혼성화되도록 합니다.
참고: 하이브리드화 온도는 프로브마다 다릅니다. - 다음날 피펫으로 프로브 용액을 흡인하고 -20°C의 튜브에 보관하여 여러 번 재사용할 수 있도록 합니다.
- 다음과 같이 배아를 씻으십시오.
- 65°C에서 100% HYB로 15분 동안 배아를 세척한다.
- 배아를 65°C에서 각각 15분 동안 0.1% Tween-20(SSCT, 재료 표 참조)을 함유하는 2x 표준 식염수 시트레이트에서 75%, 50% 및 25% HYB로 순차적으로 세척합니다.
- 배아를 65°C에서 2x SSCT로 15분 동안 세척합니다.
- 65°C에서 0.2x SSCT로 15분 동안 배아를 세척합니다.
- 실온에서 0.02% Tween-20(MABT, 재료 표 참조)을 함유하는 말레산 완충액에서 10분 동안 배아를 2회 세척합니다.
- 혼성화되고 세척된 배아를 2% 차단 용액-1로 실온에서 최소 2시간 동안 차단합니다( 재료 표 참조).
- 블로킹 용액-1을 새로운 2% 블로킹 용액-1에서 안티디곡시제닌 AP(1:4,000 희석, 재료 표 참조)로 교체하고 4°C에서 12-14시간 동안 밤새 흔들어 줍니다.
- 실온에서 MABT에서 30 분 동안 배아를 4 번 씻으십시오.
알림: 세 번째 세탁 시 냉장고에서 BM 보라색( 재료 표 참조)을 꺼내고 이후 세탁 시 가끔 흔들어주세요. - 배아를 NTMT(0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 1% Tween-20, 재료 표 참조)에서 10분 동안 2회 세척합니다.
- 피펫을 사용하여 배아에서 가능한 한 많은 NTMT를 제거하십시오. BM 보라색 AP 기질로 교체하고 어둠 속에서 실온에서 배아를 염색합니다. 염색 정도를 제어하기 위해 30분마다 색상 변화를 모니터링합니다.
알림: 특정 염색 시간이 다르며 각 프로브에 따라 조정해야 합니다. 배아를 37°C에서 배양하면 반응을 가속화할 수 있습니다. 4°C에서 배아를 배양하면 반응 시간을 늘릴 수 있으며 밤새 수행할 수 있습니다. - 원하는 정도로 현상되면 NTMT로 두 번 짧게 헹구어 반응을 중지합니다. in situ 하이브리드화 후 배아를 PBST로 20분 동안 세 번 헹굽니다.
3. 임베딩
- 배아를 1x PBS 중의 5% 수크로오스에 담그고( 재료 표 참조) 4°C에서 12-14시간 동안 밤새도록 합니다.
- 배아를 덮는 용액을 1x PBS에서 15% 자당으로 변경하고 4°C에서 12-16시간 동안 밤새 배양합니다.
- 배아를 덮고 있는 용액을 1x PBS 중 30% 수크로오스로 바꾸고 4°C에서 1-2일 동안 배양한다.
참고: 배아가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 이 용액에서 배양합니다. - 극저온 몰드를 최적 절단 온도(OCT) 매체로 채웁니다( 재료 표 참조). 30% 자당의 배아를 OCT 배지를 사용하여 cryomold로 옮깁니다. 배아에서 자당을 제거하기 위해 저어줍니다.
- 배아를 조직을 위해 새로운 cryomold로 옮기고 기포의 형성을 피하면서 OCT 배지로 부드럽게 채 웁니다.
- 각 배아를 담그고 극저온 몰드의 바닥으로 밀어 넣고 각 배아를 원하는 방향(등-복부 또는 측면)으로 놓습니다. 배아를 일직선으로 유지하십시오.
참고: 각 cryomold에 하나의 배아만 배치하는 것이 좋습니다( 재료 표 참조). - 드라이아이스 에탄올 욕조의 극저온 몰드에 내장된 배아를 놓습니다.
- -80 °C에서 하룻밤 이상 12-14시간 동안 보관하십시오.
참고: 극저온 몰드는 -80°C에서 최소 한 달 동안 보관할 수 있습니다.
4. 냉동 절편
- 저온 유지 장치를 사용하여 극저온 절편을 -20°C로 설정합니다.
- cryomold에서 표본 블록을 제거하고 cryostat에 넣습니다. 식힌 척 바닥에 OCT 배지를 놓고 그 위에 블록을 놓습니다.
- 시편 블록이 면도날과 평행한지 확인합니다. 표본 주변의 과도한 OCT 배지를 조심스럽게 잘라냅니다.
- 저온 유지 장치를 사용하여 12-20 μm 두께의 섹션으로 자릅니다. 섹션을 유리 슬라이드로 빠르게 전송하여 각 슬라이드에 3-4 개의 섹션이 있도록합니다. 샘플이 실온에 도달하도록 하고 나중에 사용할 수 있도록 -80°C의 밀봉된 슬라이드 박스에 섹션을 보관합니다.
5. 면역염색
참고: GFP 염색은 절편에서 수행됩니다.
- 절편이 포함된 슬라이드를 PBS로 5분 동안 세척합니다.
- 구연산염 완충액을 전자레인지에 끓입니다.
- 슬라이드를 버퍼에 넣고 약 20분 동안 용액이 거의 끓는 상태를 유지하도록 계속 가열합니다.
참고: 이 단계는 항원 검색에 도움이 됩니다. 조직은 고온에서도 손상되지 않은 상태로 유지되어 조직의 접힘, 손상 또는 박리를 방지하여 염색 품질을 향상시킵니다. - 다음 단계 전에 샘플을 실온으로 천천히 식히십시오. 과잉 용액을 배출하고 티슈 조각으로 각 섹션 주변을 조심스럽게 건조시킨 다음 발수성 펜 ( 재료 표 참조)으로 섹션 주위에 원을 그려 소수성 장벽을 형성합니다. 조직 부분이 건조하지 않도록 주의하십시오.
- 슬라이드를 PBS로 2회 세척하고, 각 세척 동안 10분 동안 인큐베이션한다.
- 실온에서 블로킹 용액-2( 재료 표 참조)에서 2시간 동안 블럭합니다.
- 슬라이드 당 1차 항체 용액(마우스 단일클론 α-GFP, 1:250, 표 참조)을 피펫으로 하고, 슬라이드를 면역조직화학 습윤 상자에서 하룻밤 동안 4°C에서 배양한다.
- 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고, 각 세척 동안 10분 동안 인큐베이션한다.
- 초과 PBS를 배출하십시오. 적절한 2차 항체(1:400, 재료 표 참조)와 함께 슬라이드를 PBS의 실온에서 1시간 동안 인큐베이션합니다.
- 슬라이드를 PBS로 3회 세척하고, 각 세척 동안 10분 동안 인큐베이션한다.
- 여분의 PBS를 배출하고 마운팅 매체를 슬라이드에 피펫팅한 다음 슬라이드 커버슬립으로 장착합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 하나의 mRNA와 하나의 단백질의 발현 패턴을 동시에 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1은 실험 워크플로를 보여줍니다. 5-HT2C 수용체는 신경전달물질인 세로토닌(5-hydroxytryptamine, 5-HT)에 의해 결합된 5-HT 수용체의 아형이다. 중추신경계(CNS)에 널리 분포되어 있으며 식욕, 기분, 불안, 생식 행동 등 다양한 뇌 기능을 크게 조절할 수 있다13. CNS에서 5-HT2C의 발현은 형질전환 계통 Tg(foxp2:egfp-caax)에 의해 검출되었으며, 여기서 foxP2 뉴런은 플루오레세인 녹색 형광 단백질(GFP)에 의해 표지됩니다. GFP는 야생형 제브라피쉬에서는 발현되지 않고 형질전환 계통에서만 발현되었습니다. RNA(5-HT2C, htr2c에 대한 프로브, 도 2A) 및 단백질(GFP, antiGFP, 도 2B)의 발현의 동시 검출은 단백질 및 mRNA 공동국소화 분석에 사용될 수 있다.
징크-핑거 전사 인자인 인슐린종 관련 1a(insm1a)는 종양 감소 라이브러리에서 처음 확인되었으며 척추동물 중추 및 말초 신경계와 신경내분비계의 형성 및 분화에 여러 기능을 했습니다. 최근 연구에 따르면 insm1a는 운동 뉴런 발달의 중요한 조절자입니다. 제브라피쉬 척수 및 운동 뉴런에서 insm1a의 발현은 형질전환 계통 Tg(hb9:egfp)에 의해 검출되었으며, 여기서 hb9 뉴런은 플루오레세인 GFP에 의해 표지됩니다. GFP는 야생형 제브라피쉬에서는 발현되지 않고 형질전환 계통에서만 발현되었습니다. RNA(insm1a, insm1a에 대한 프로브, 그림 3A)와 단백질(GFP, antiGFP, 그림 3B)의 발현을 동시에 검출하는 것은 단백질 및 mRNA 공동 국소화 분석에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 단백질과 RNA의 공동 국소화를 감지하여 공간적 관계를 이해하는 데 성공적으로 적용되었습니다.
그림 1: 방법의 개요. 이 순서도는 실험적 워크플로를 보여줍니다. 워크플로는 최소 9일 내에 완료할 수 있지만(워크플로의 각 단계 오른쪽 상단 모서리에 있는 일 수 참조) 프로토콜에 설명된 대로 일부 단계는 더 긴 기간에 완료할 수 있습니다. 약어: PFA = 파라포름알데히드; O/N = 하룻밤; RT = 실온. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Tg의 5-HT2C 프로브와 GFP 항체로 염색된 전체 마운트 배아(foxP2:egfp-caax). 명시야(A), 형광(B) 및 병합된 이미지(C)는 foxP2 뉴런 및 축삭 관에서 5-HT2C(htr2c에 대한 프로브, A) 및 GFP(antiGFP, B) 발현을 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Tg(hb9:egfp)에서 insm1a 프로브 및 GFP 항체로 염색된 전체 마운트 배아. 명시야(A), 형광등(B) 및 병합된 이미지(C)는 hb9 뉴런에서 insm1a(insm1a, A에 대한 프로브) 및 GFP(항-GFP, B) 발현을 보여줍니다. 스케일 바 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 배아 | 시간 |
| 24 마력의 | 2 분 |
| 30 마력제 | 3 분 |
| 36 마력(HPF) | 5 분 |
| 48 마력파 | 10 분 |
| 72 마력파 | 15 분 |
| 96 마력의 | 45 분 |
| 4-5 DPF | 60 분 |
표 1: 제브라피쉬 배아의 프로테이나제 K 소화 시간. 약어: hpf = 수정 후 시간; DPF = 수정 후 일수.
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Discussion
이 프로토콜은 제브라피쉬 배아에 대한 colocalization 실험에서 중요한 단계인 현장 혼성화와 면역조직화학의 조합을 제안합니다. 이 방법은 하나의 mRNA와 하나의 단백질을 동시에 분석하는 쉽고 효율적인 방법입니다. 제브라피쉬 배아에 대해 제자리 하이브리드화 및 항체 염색을 수행했습니다. 이전에 발표된 여러 프로토콜과 대조적으로14,15,16, 면역형광 및 면역조직화학은 단백질 발현을 탐색하는 데 사용되었습니다. 섹션17에서 사용하기 위해 적절하게 검증된 제브라피쉬 특이적 항체는 거의 없습니다. 이전 연구에서는 면역형광, 면역조직화학 또는 제자리 혼성화라는 한 가지 기술만 사용했습니다. RNA와 단백질을 분석하기 위해 in situ hybridization과 immunohistochemistry를 결합하면 한 기술의 한계를 극복할 수 있습니다. 첫 번째 단계는 mRNA가 분해되지 않도록 크게 보호하는 in situ 하이브리드화였습니다. 항원 검색은 면역조직화학 염색 동안 항체 결합의 프로테이나제 K 처리에 의한 중단을 피하기 위해 가열에 의해 유도되었다. 이 접근법이 모든 항원에 효과가 있는지 여부는 추가 검사가 필요합니다. 절편의 이미지는 5-HT2C 수용체가 foxP2 뉴런에서 공동 발현되고 insm1a 수용체가 hb9 뉴런에서 공동 발현됨을 보여주었습니다.
전체 장착 in situ 하이브리드화는 샘플의 무결성을 크게 보존합니다. 절편에 이은 제자리 하이브리드화는 항체 염색을 위한 배양 시간을 감소시킬 수 있습니다. 또한, in situ 하이브리드화 후 항체 염색은 형광 소광을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
다음 특정 단계는 실험의 성공에 필수적입니다. 첫 번째 중요한 단계는 배아를 4 % PFA로 재 고정하는 것입니다. 이 단계는 PFA가 프로테이나제 K를 비활성화하기 때문에 프로테이나제 K 반응을 중지합니다. 샘플은 모든 배아를 PFA에 노출시키기 위해 부드럽게 혼합되어야 합니다. 튜브는 배아가 용액에 고르게 분포되도록 옆으로 눕힐 수도 있습니다. 두 번째 중요한 단계는 OCT 이식 중 배아를 처리하는 것입니다. 배아는 특정 방향(등-복부 또는 측면)으로 배열되어야 하며, 모든 배아에 대해 거의 동일한 영역에서 섹션으로 절단될 수 있도록 똑바로 유지해야 합니다. 작은 바늘은 점성이 있는 OCT 배지에서 작고 의식적인 움직임을 만들어 배아를 찾고 기포를 제거하는 데 사용됩니다.
설명된 시나리오에 적용할 수 있는 몇 가지 잠재적인 수정 사항이 있습니다. 제 자리 하이브리드화에서 프로테이나제 K의 소화 시간은 제브라피쉬 배아의 다양한 발달 단계에 따라 결정될 수 있습니다(표 1). 또한 극저온 절편의 두께는 매우 유연하며 실험 요구 사항에 따라 결정할 수 있습니다. 이 접근 방식은 광범위한 실험에 적합할 것으로 예상되지만 몇 가지 잠재적인 제한 사항이 있습니다. 이 절차의 성공적인 실행은 두 번의 연속적인 실험을 통해 완전한 샘플을 유지하는 데 달려 있습니다. 이 프로토콜에는 여러 가지 가능한 일시 중지 지점이 있습니다. 탈수된 배아는 -20°C에서 수개월 동안 30% 수크로오스 용액에 저장될 수 있다14. 유사하게, 제조된 슬라이드는 -20°C에서 1년 이상 동안 슬라이드 박스에 보관될 수 있다14. 냉동 블록은 -80°C에서 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
면역조직화학과 결합된 제자리 혼성화를 위한 이 프로토콜은 제 브라피쉬 배아에서 5-HT2C 및 insm1a 발현을 검출하는 데 성공적인 것으로 나타났으며 다양한 발달 단계에서 다양한 조직에 쉽게 적용할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 뉴런 또는 신경교 세포에 적용할 수 있어 신경과학자에게 강력한 조사 접근 방식을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 중국 난퉁 과학 기술 재단 (MS12019011), 중국 난퉁 과학 기술 재단 (JC2021058) 및 장쑤 고등 교육 기관 자연 과학 재단 (21KJB180009)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
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