Summary
Detta protokoll beskriver hur man får bilder genom att kombinera in situ hybridisering och immunhistokemi av zebrafisk embryonala sektioner. In situ-hybridisering utfördes före kryosektion, följt av antikroppsfärgning. Det är användbart att detektera uttrycksmönstren för två gener i zebrafisk om det finns en brist på antikroppar.
Abstract
Som ryggradsdjur har zebrafisken använts i stor utsträckning i biologiska studier. Zebrafisk och människor delar hög genetisk homologi, vilket möjliggör användning som modell för mänskliga sjukdomar. Genfunktionsstudien baseras på detektion av genuttrycksmönster. Även om immunhistokemi erbjuder ett kraftfullt sätt att analysera proteinuttryck, begränsar det begränsade antalet kommersiellt tillgängliga antikroppar i zebrafisk tillämpningen av costaining. In situ-hybridisering används ofta i zebrafiskembryon för att detektera mRNA-uttryck. Detta protokoll beskriver hur man får bilder genom att kombinera in situ hybridisering och immunhistokemi för zebrafiskembryosektioner. In situ-hybridisering utfördes före kryosektion, följt av antikroppsfärgning. Immunhistokemi och avbildning av en enda kryosektion utfördes efter in situ-hybridisering. Protokollet är till hjälp för att reda ut uttrycksmönstret för två gener, först genom in situ-transkriptdetektion och sedan genom immunhistokemi mot ett protein i samma sektion.
Introduction
Zebrafisken är en kraftfull ryggradsdjurmodell för studier av utveckling och genetik 1,2. Zebrafisk och människor delar hög genetisk homologi (70% av generna delas med det mänskliga genomet), vilket möjliggör användning som modell för mänskliga sjukdomar3. I zebrafisk är det ganska vanligt att upptäcka uttrycksmönstren för två gener och deras rumsliga förhållande. Immunohistokemi användes först 1941 för att detektera patogener i infekterade vävnader genom att applicera FITC-märkta antikroppar4. Målproteinet i vävnadssektionen märks först med en primär antikropp, och sektionen märks sedan med en sekundär antikropp mot den primära antikroppens värdart immunglobulin. Antikroppsfärgning är ett robust tillvägagångssätt för att detektera lokalisering av proteiner, vilket ger hög optisk upplösning på intracellulär nivå. Antalet tillgängliga antikroppar är dock mycket begränsat hos zebrafiskar. En nyligen genomförd studie visar att cirka 112 000 antikroppar är kommersiellt tillgängliga för möss; Mycket få antikroppar har dock visat sig vara tillförlitliga i zebrafisk5.
Istället har in situ-hybridisering i zebrafisk använts i stor utsträckning för analys av genuttrycksmönster. Denna metod användes först för att bedöma genuttryck i Drosophila-embryon på 1980-talet6,7, och sedan dess har denna teknik kontinuerligt utvecklats och förbättrats. Ursprungligen användes radiomärkta DNA-sonder för att detektera mRNA-transkript; Den rumsliga upplösningen var dock relativt låg och det fanns potentiella hälsorisker orsakade av radioaktiviteten. Därefter förlitar sig in situ-hybridisering på RNA-sonderna märkta med digoxigenin (DIG) eller fluorescein (Fluo), vilka är konjugerade till alkaliskt fosfatas (AP) eller detekteras genom fluorescerande tyramidsignalförstärkning (TSA)8,9. Även om TSA har använts för att detektera två eller tre gener, är DIG-märkning av RNA-sonder och antiDIG AP-konjugerade antikroppar fortfarande mycket känsliga, stabila och allmänt använda metoder för in situ-hybridisering. Därför är kommersialiserade antikroppar i kombination med DIG-märkta in situ-sonder användbara för att ge insikt i proteinlokalisering och uttryck av en gen.
Helmonterade embryon kan inte avslöja det rumsliga förhållandet mellan gener på grund av den låga optiska upplösningen, även om zebrafiskembryon är små och transparenta10. Därför är sektionering nödvändig för att analysera uttrycksmönster av gener på intracellulär nivå. Kryosektion har använts i stor utsträckning i zebrafisk eftersom det är lätt att utföra och effektivt kan bevara antigenet. Därför erbjuder in situ-hybridisering i kombination med immunhistokemi i zebrafiskkryosektioner ett kraftfullt sätt att analysera uttrycksmönstren för två gener. En kombination av in situ-hybridisering och immunhistokemi har applicerats på zebrafisk11. Proteinas K-behandling användes emellertid för att förbättra sondpenetrationen på bekostnad av antigenintegriteten. För att övervinna denna begränsning använder detta protokoll uppvärmning för att inducera antigenhämtning. Detta protokoll är inte bara tillämpligt på embryon i olika stadier och vävnadssektioner av olika tjocklek (14 μm huvudsektioner och 20 μm ryggmärgssektioner), men det har också verifierats genom att använda gener uttryckta i två organ, inklusive huvudet och ryggmärgen.
Denna artikel kommer att beskriva hur man kombinerar in situ hybridisering och antikroppsfärgning i zebrafiskembryon i kryosektioner. Mångsidigheten hos detta protokoll demonstreras genom att använda ett antal in situ hybridisering-immunhistokemiska kombinationer, inklusive in situ-hybridiseringsprober för två olika neuroner. Denna metod är lämplig för detektion av mRNA och protein i olika regioner och embryon av olika åldrar, liksom uttrycksmönstren för två gener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Nantong University (nr S20191210-402).
1. Insamling av zebrafiskembryon
- Sätt upp ett par zebrafiskar i avelstankar kvällen innan äggen ska samlas in, den ena en transgen zebrafisk och den andra en AB vildtyp zebrafisk (Tg (foxP2: egfp-caax) X AB vildtyp eller Tg (hb9: egfp) X AB vildtyp) (se materialtabellen). Använd en diagonal plastavdelare för att separera hane och hona för att förhindra fysisk åtkomst. Följande dag, montera den övre delen av avelstanken i en ren nedre del fylld med färskt vatten och ta bort avdelaren av avelstanken. Låt fisken para sig i 10-20 minuter och samla äggen efter att de har sjunkit till botten av avelstanken.
- Odla embryon i E3-embryomedium (se materialtabellen) som innehåller metylenblått (1 ml 0,05% metylenblått i 1 liter E3-embryomedium) vid 28,5 °C.
- Behandla embryon vid 24 h efter befruktning (hpf) med fenyltiourea (PTU, se materialtabellen) för att förhindra pigmentbildning.
OBS: Djur av båda könen används i försök.
2. In situ-hybridisering
OBS: Vattnet som används för steg 2.1-2.11 är dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlat vatten (se materialtabellen).
- Fixa ~ 10 embryon med 0,5-1 ml färsk 4% paraformaldehyd (PFA, se materialtabellen) i ett 1,5 ml mikrofugerör vid 4 ° C över natten i 12-14 timmar.
OBS: Protokollet för in situ-hybridisering modifieras något från tidigare publicerad litteratur12. PFA måste nyberedas och lagras vid 4 °C inom en vecka efter användning eller i en månad vid -20 °C. Alla följande steg i in situ-hybridisering utfördes med användning av 1,5 ml mikrofugerör. - Använd pincett för att ta bort huden på endast embryon äldre än 48 hpf.
OBS: Huden avlägsnas för att underlätta penetrering av RNA-sonder i stamområdet hos embryon äldre än 48 hpf. - Dehydrera embryona gradvis genom tvättning med 25%, 50% och 75% metanol i 1x fosfatbuffrad saltlösning innehållande 0,1% Tween-20 successivt (PBST, se materialtabellen) i 5 minuter vardera vid rumstemperatur. Tvätta sedan embryon i 5 minuter i 100% metanol vid rumstemperatur. Inkubera embryona i 100 % metanol vid -20 °C under minst en natt i 12–14 timmar.
OBS: Dehydrerade embryon kan förvaras i 100% metanol vid -20 °C i 6 månader. - Rehydrera embryona gradvis genom att tvätta med 75%, 50% och 25% metanol i PBST successivt i 5 minuter vardera vid rumstemperatur. Tvätta embryot tre gånger med PBST i 5 minuter vardera vid rumstemperatur.
- Smält embryona med 10 μg/ml proteinas K (se materialtabellen) i PBST vid rumstemperatur (se tabell 1).
- Tvätta embryona med PBST i 5 min. Utför detta tvättsteg tre gånger.
- Fixera de tvättade embryona i 4% PFA i 15 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Detta steg stoppar matsmältningen eftersom PFA inaktiverar proteinas K. Se till att provet blandas försiktigt för att exponera alla embryon för PFA; Rören kan placeras på sina sidor för att jämnt fördela embryon i lösningen. Denna PFA behöver inte vara färsk (den kan kylas i upp till 2 veckor). - Tvätta embryot tre gånger med PBST, inkubera i 5 minuter under varje tvätt.
- Utför prehybridisering av embryona genom att inkubera med prehybridiseringslösning (preHYB, se materialtabellen) vid 65 °C i 5 minuter. Byt ut preHYB mot hybridiseringslösning (HYB, se materialtabellen) och prehybridisera i minst 4 h i HYB.
OBS: Innan du fortsätter med förhybridisering, förvärm lösningarna till 65 °C. Formamid (se materialtabellen) används för att bibehålla vävnadens form och struktur. Formamid förhindrar också bindning av icke-homologa fragment vid låga temperaturer. - Värm sonden (Insm1a eller 5-HT2C) i HYB i 5 minuter vid 95 °C innan den tillsätts till embryona. Använd sonden vid 1 μg/ml HYB. Ta bort så mycket preHYB som möjligt utan att låta embryona komma i kontakt med luften och tillsätt förvärmd sond i HYB till röret som innehåller embryon.
OBS: En märkt RNA-sond kan användas för att hybridisera med en mål-mRNA-sekvens i embryon. Därför kan sonden användas för att detektera uttrycket av en gen av intresse och placeringen av mRNA. - Låt sonden hybridisera över natten (12–14 timmar) vid 50–70 °C.
OBS: Hybridiseringstemperaturen skiljer sig åt för olika sonder. - Nästa dag, aspirera sondlösningen med en pipett och förvara den i ett rör vid -20 ° C så att den kan återanvändas många gånger.
- Tvätta embryon enligt följande:
- Tvätta embryona i 15 min med 100% HYB vid 65 °C.
- Tvätta embryona sekventiellt med 75%, 50% och 25% HYB i 2x standard saltlösningscitrat innehållande 0,1% Tween-20 (SSCT, se materialtabellen) i 15 minuter vardera vid 65 ° C.
- Tvätta embryona i 15 min i 2x SSCT vid 65 °C.
- Tvätta embryona i 15 minuter i 0,2x SSCT vid 65 °C.
- Tvätta embryona två gånger i 10 min i maleinsyrabuffert innehållande 0,02% Tween-20 (MABT, se materialtabellen) vid rumstemperatur.
- Blockera de hybridiserade och tvättade embryona i minst 2 timmar vid rumstemperatur med 2% blockerande lösning-1 (se materialtabellen).
- Byt ut blockeringslösningen-1 mot antidigoxigenin AP (spädning 1:4 000, se materialtabellen) i en ny 2 % blockerande lösning-1 och skaka över natten i 12–14 timmar vid 4 °C.
- Tvätta embryona fyra gånger i 30 minuter i MABT vid rumstemperatur.
OBS: Ta bort BM lila (se materialtabellen) från kylskåpet under den tredje tvätten och skaka den ibland under efterföljande tvättar. - Tvätta embryona två gånger i 10 min i NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, se materialtabellen).
- Använd en pipett för att ta bort så mycket NTMT som möjligt från embryon. Byt ut med BM lila AP-substrat och färga embryon vid rumstemperatur i mörkret. Övervaka färgändringarna var 30: e minut för att kontrollera graden av färgning.
OBS: Den specifika färgningstiden är olika och måste justeras enligt varje sond. Inkubation av embryon vid 37 °C kan påskynda reaktionen. Inkubation av embryon vid 4 °C kan öka reaktionstiden och kan göras över natten. - När det har utvecklats i önskad utsträckning, stoppa reaktionen genom att skölja kort med NTMT två gånger. Efter in situ-hybridisering , skölj embryona med PBST tre gånger i 20 minuter.
3. Inbäddning
- Sänk ner embryona i 5% sackaros i 1x PBS (se materialtabellen) över natten i 12-14 timmar vid 4 °C.
- Byt lösningen som täcker embryona till 15 % sackaros i 1x PBS och inkubera över natten i 12–16 timmar vid 4 °C.
- Byt lösningen som täcker embryona till 30 % sackaros i 1x PBS och inkubera i 1-2 dagar vid 4 °C.
OBS: Inkubera i denna lösning tills embryona sjunker till botten av röret. - Fyll en kryomol med optimalt skärtemperaturmedium (OCT) (se materialtabellen). Överför embryona i 30% sackaros till kryopolen med OCT-medium. Rör om dem för att ta bort sackarosen från embryon.
- Överför embryona till en ny kryomol för vävnad och fyll den försiktigt med OCT-medium, undvik bildandet av bubblor.
- Sänk ner varje embryo, tryck det till botten av kryoformen och placera varje embryo i önskad orientering (antingen dorsal-ventral eller lateral). Håll embryon i en rak linje.
OBS: Det rekommenderas starkt att endast placera ett embryo i varje kryomol (se materialtabellen). - Placera de inbäddade embryona i kryoformar i ett torrisetanolbad.
- Förvaras vid -80 °C åtminstone över natten i 12-14 timmar.
OBS: Kryoformarna kan förvaras vid -80 °C i minst en månad.
4. Kryosektion
- Ställ in kryosektionerna med en kryostat på -20 °C.
- Ta bort provblocket från kryomolen och placera det i kryostaten. Placera OCT-medium på basen av den kylda chucken och placera blocket ovanpå.
- Se till att provblocket är parallellt med rakbladet. Klipp försiktigt bort överflödigt OCT-medium runt provet.
- Skär i 12-20 μm tjocka sektioner med en kryostat. Överför snabbt sektionerna till glasskivor så att varje bild har 3-4 sektioner. Låt proverna uppnå rumstemperatur och förvara sektionerna i en förseglad bildlåda vid -80 °C för senare användning.
5. Immunfärgning
OBS: GFP-färgning utförs på sektionerna.
- Tvätta bilderna som innehåller sektionerna med PBS i 5 minuter.
- Värm citratbufferten till kokning i mikrovågsugn.
- Placera glasen i bufferten och fortsätt att värma för att hålla lösningen nära kokning i cirka 20 minuter.
OBS: Detta steg hjälper till att hämta antigener. Vävnaden förblir intakt även vid höga temperaturer, vilket förbättrar färgningskvaliteten genom att förhindra vikning, skada eller lossning av vävnaderna. - Låt proverna svalna långsamt till rumstemperatur före nästa steg. Töm överskottslösningen, torka försiktigt området runt varje sektion med en bit vävnad och rita en cirkel runt sektionen med en vattenavvisande penna (se materialtabellen) för att bilda en hydrofob barriär. Var försiktig så att du inte torkar vävnadssektionerna.
- Tvätta glasen två gånger med PBS, inkubera i 10 minuter under varje tvätt.
- Blockera i 2 timmar i blockerande lösning-2 (se materialtabellen) vid rumstemperatur.
- Pipettera primär antikroppslösning (monoklonal α-GFP hos mus, 1:250, se materialtabellen) per objektglas och inkubera objektglasen i en immunhistokemisk våtlåda vid 4 °C över natten.
- Tvätta glasen tre gånger med PBS, inkubera i 10 minuter under varje tvätt.
- Töm överskott av PBS. Inkubera objektglasen med lämplig sekundär antikropp (1:400, se materialtabellen) i 1 timme vid rumstemperatur i PBS.
- Tvätta glasen tre gånger med PBS, inkubera i 10 minuter under varje tvätt.
- Töm överflödig PBS, pipettera monteringsmediet på bilden och montera med en glidtäcke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll kan användas för att samtidigt undersöka uttrycksmönstret för ett mRNA och ett protein. Bild 1 visar det experimentella arbetsflödet. 5-HT2C-receptorn är en subtyp av 5-HT-receptorn bunden av neurotransmittorn serotonin (5-hydroxytryptamin, 5-HT). Det distribueras i stor utsträckning i centrala nervsystemet (CNS) och kan avsevärt reglera en mängd olika hjärnfunktioner, inklusive aptit, humör, ångest och reproduktivt beteende13. Uttrycket av 5-HT2C i CNS detekterades av den transgena linjen Tg (foxp2: egfp-caax), där foxP2-neuroner märks av fluoresceingrönt fluorescerande protein (GFP). GFP uttrycktes inte i vildtyp zebrafisk utan endast i den transgena linjen. Samtidig detektion av uttrycket av RNA (5-HT2C, sonden för htr2c, figur 2A) och protein (GFP, antiGFP, figur 2B) kan användas för protein- och mRNA-samlokaliseringsanalys.
Insulinomassocierad 1a (insm1a), en zinkfingertranskriptionsfaktor, identifierades först från tumörreduktionsbiblioteket och spelade flera funktioner i bildandet och differentieringen av ryggradsdjurens centrala och perifera nervsystem och neuroendokrina system. Nya studier har visat att insm1a är en viktig regulator för utveckling av motorneuroner. Uttrycket av insm1a i zebrafiskens ryggmärg och motorneuroner detekterades av den transgena linjen Tg (hb9: egfp), där hb9-neuroner märks av fluorescein GFP. GFP uttrycktes inte i vildtyp zebrafisk utan endast i den transgena linjen. Samtidig detektion av uttrycket av RNA (insm1a, sonden för insm1a, figur 3A) och protein (GFP, antiGFP, figur 3B) kan användas för protein- och mRNA-samlokaliseringsanalys. Detta protokoll tillämpades framgångsrikt för att detektera samlokalisering av protein och RNA för att förstå deras rumsliga förhållande.
Figur 1: Översikt över metoden. Det här flödesschemat visar ett experimentellt arbetsflöde. Arbetsflödet kan slutföras på minst 9 dagar (se antalet dagar i det övre högra hörnet i varje fas i arbetsflödet), även om vissa steg kan slutföras under en längre period, enligt beskrivningen i protokollet. Förkortningar: PFA = paraformaldehyd; O/N = över natten; RT = rumstemperatur. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Helmonterade embryon färgade med 5-HT2C-sond och GFP-antikropp i Tg (foxP2:egfp-caax). Ljusfält (A), fluorescerande (B) och sammanslagna bilder (C) visar 5-HT2C (sonden för htr2c, A) och GFP (antiGFP, B) uttryck i foxP2-neuroner och axonkanaler. Skalstapel = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Helmonterade embryon färgade med insm1a-sond och GFP-antikropp i Tg (hb9: egfp). Ljusfält (A), fluorescerande (B) och sammanslagna bilder (C) visar insm1a (sonden för insm1a, A) och GFP (anti-GFP, B) uttryck i hb9-neuroner. Skalstapel = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Embryon | Tid |
| 24 hkf | 2 minuter |
| 30 hkf | 3 minuter |
| 36 hkf | 5 minuter |
| 48 hkf | 10 minuter |
| 72 hkf | 15 minuter |
| 96 hkf | 45 minuter |
| 4-5 dpf | 60 minuter |
Tabell 1: Proteinas K-uppslutningstid för zebrafiskembryon. Förkortningar: hpf = timmar efter befruktning; DPF = dagar efter befruktning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll föreslår en kombination av in situ-hybridisering och immunhistokemi, ett viktigt steg i samlokaliseringsexperimenten på zebrafiskembryon. Denna metod fungerar som ett enkelt och effektivt sätt att samtidigt analysera ett mRNA och ett protein. In situ-hybridisering och antikroppsfärgning utfördes på zebrafiskembryon. I motsats till flera protokoll publicerade tidigare14,15,16 användes immunofluorescens och immunohistokemi för att utforska proteinuttryck. Få zebrafiskspecifika antikroppar har validerats på lämpligt sätt för användning i avsnitt17. Tidigare studier har endast använt en teknik: immunofluorescens, immunhistokemi eller in situ-hybridisering. Att kombinera in situ-hybridisering och immunhistokemi för att analysera RNA och protein övervinner begränsningarna för någon teknik. Det första steget var in situ-hybridisering, vilket i hög grad skyddar mRNA från nedbrytning. Antigenhämtning inducerades genom upphettning för att undvika störning av proteinas K-behandling av antikroppsbindning under immunhistokemisk färgning. Huruvida detta tillvägagångssätt fungerar för alla antigener kommer att kräva ytterligare testning. Bilder av sektionerna visade att 5-HT2C-receptorn samuttrycktes i foxP2-neuroner och att insm1a-receptorn samuttrycktes i hb9-neuroner.
Helmonterad in situ-hybridisering bevarar i hög grad provernas integritet. In situ-hybridisering följt av sektionering kan minska inkubationstiden för antikroppsfärgning. Dessutom kan antikroppsfärgning efter in situ-hybridisering hjälpa till att undvika fluorescenssläckning.
Följande specifika steg är avgörande för experimentets framgång. Det första kritiska steget är att fixa embryot i 4% PFA. Detta steg stoppar proteinas K-reaktionen eftersom PFA inaktiverar proteinas K. Proverna ska blandas varsamt för att exponera alla embryon för PFA. Röret kan också placeras på sin sida så att embryon fördelas jämnt i lösningen. Det andra kritiska steget är behandlingen av embryot under OCT-implantation. Embryona bör ordnas i en specifik riktning (antingen dorsal-ventral eller lateral), hålla dem raka så att de kan skäras i sektioner från ungefär samma område för alla embryon. En liten nål används för att göra små, medvetna rörelser i det viskösa OCT-mediet för att lokalisera embryot och ta bort bubblor.
Det finns flera möjliga ändringar som kan tillämpas på det beskrivna scenariot. Digestionstiden för proteinas K in situ-hybridisering kan bestämmas enligt zebrafiskembryonas olika utvecklingsstadier (tabell 1). Dessutom är kryosektionernas tjocklek mycket flexibel och kan bestämmas enligt experimentella krav. Även om det förutspås att detta tillvägagångssätt kommer att vara lämpligt för ett brett spektrum av experiment, har det vissa potentiella begränsningar. Det framgångsrika genomförandet av denna procedur beror på att ett fullständigt prov upprätthålls genom två på varandra följande experiment. Det finns flera möjliga pauspunkter i detta protokoll. De dehydrerade embryona kan förvaras i 30% sackaroslösning vid -20 °C i flera månader14. På samma sätt kan de förberedda objektglasen förvaras i en bildlåda vid -20 °C i mer än 1 år14. De frysta blocken kan förvaras vid -80 °C i tre månader.
Detta protokoll för in situ-hybridisering i kombination med immunhistokemi har visat sig vara framgångsrikt för att detektera 5-HT2C och insm1a-uttryck i zebrafiskembryon och kan enkelt appliceras på en mängd olika vävnader i olika utvecklingsstadier. Dessutom kan detta protokoll tillämpas på neuroner eller gliaceller, vilket ger en robust undersökningsmetod för neuroforskare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) och Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Blocking solution-1 | made in lab | N/A | Dissolve the blocking reagent in 1X MAB to a final concentration of 10% (wt/vol). Autoclave and store at -20 °C before use. |
| Blocking solution-2 | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
References
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
