Влияние гиалуроновой кислоты 35 кДа на модель in vitro преждевременного повреждения тонкой кишки и заживления с использованием монослоев энтероидного происхождения
Summary
Этот протокол описывает метод установления и выполнения анализа раны царапин на двумерных (2D) монослоях, полученных из трехмерных (3D) энтероидов, выделенных из подвздошной кишки приматов нечеловеческих.
Abstract
Анализы раны с царапинами in vitro обычно используются для изучения механизмов и характеристик заживления эпителия в различных типах тканей. Здесь мы описываем протокол для генерации двумерного (2D) монослоя из трехмерных (3D) энтероидов нечеловеческих приматов, полученных из кишечных крипт терминальной подвздошной кишки. Эти монослои, полученные из энтероидов, затем использовались в анализе in vitro для проверки способности гиалуроновой кислоты 35 кДа (HA35), имитации ГК грудного молока, способствовать миграции и пролиферации клеток вдоль края эпителиальной раны. После того, как монослои были выращены до слияния, их вручную царапали и обрабатывали HA35 (50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл) или контрольным (PBS). Миграция и пролиферация клеток в щель были визуализированы с помощью микроскопа с передаваемым светом, оборудованного для визуализации живых клеток. Закрытие раны было количественно определено как процент заживления ран с помощью плагина Wound Healing Size Plugin в ImageJ. Площадь царапин и скорость миграции клеток и процент закрытия раны были измерены в течение 24 ч. HA35 in vitro ускоряет заживление ран в тонкокишечных энтероидных монослоях, вероятно, за счет комбинации пролиферации клеток на краю раны и миграции в раневую область. Эти методы потенциально могут быть использованы в качестве модели для изучения кишечной регенерации в недоношенном тонком кишечнике человека.
Introduction
Некротизирующий энтероколит (НЭК) является одним из наиболее распространенных желудочно-кишечных чрезвычайных ситуаций у недоношенных детей1. Заболевание характеризуется сильным воспалением кишечника, которое может быстро ухудшиться до некроза кишечника, сепсиса и потенциально смерти. Хотя этиология неясна, данные свидетельствуют о том, что NEC является многофакторным и результатом сложного взаимодействия кормления, аномальной бактериальной колонизации и незрелого кишечного эпителия 2,3. Недоношенные дети имеют повышенную проницаемость кишечника, аномальную бактериальную колонизацию и низкую регенеративную способность энтероцитов 4,5, что увеличивает риск дисфункции кишечного барьера, бактериальной транслокации и развития NEC. Поэтому определение стратегий или вмешательств для ускорения созревания эпителия кишечника и содействия регенерации или заживлению кишечного эпителия имеет решающее значение для предотвращения этого смертельного заболевания.
Исследования показали, что грудное молоко (ГМ) защищает от НЭК у недоношенных детей 6,7,8,9,10,11. Исследования на людях и животных показали, что формула на основе крупного рогатого скота увеличивает проницаемость кишечника и напрямую токсична для эпителиальных клеток кишечника 2,12. Хотя они не полностью выяснены, данные свидетельствуют о том, что защитные эффекты HM опосредованы биологически активными компонентами, такими как лактоферрин, иммуноглобулин A (IgA) и олигосахариды HM13. HM также богат гиалуронаном (HA), уникальным несульфатированным гликозаминогликаном с повторяющейся D-глюкуроновой кислотой и N-ацетил-D-глюкозаминовыми дисахаридами14,15. Важно отметить, что мы показали, что пероральный прием 35 кДа ГК (HA35), имитирующий HM HA, ослабляет тяжесть повреждения кишечника, предотвращает бактериальную транслокацию и снижает смертность в мышиной NEC-подобной модели кишечного повреждения16,17.
Здесь дополнительно исследуется влияние HA35 на заживление и регенерацию кишечника in vitro. В настоящее время наиболее широко используемым анализом in vitro для ранирования и восстановления кишечника является анализ царапины на ране, выполняемый в монослоях клеток колоректального рака (CRC). Физиологическая значимость такой модели для кишечника недоношенных детей ограничена, поскольку восстановление ран CRC-клеток в значительной степени зависит от высокопролиферативной природы раковых клеток, а не от процессов восстановления, управляемых стволовыми клетками18. Чтобы преодолеть это ограничение, здесь описано создание 2D-модели энтероидной царапины раны, включая процедуру выделения и поддержания первичных энтероидов тонкой кишки, полученных из стволовых клеток, от недоношенных нечеловеческих приматов (NHP). Учитывая, что преждевременный НЭК чаще всего сообщается в дистальной тонкой кишке, использование первичных органоидов эпителиальных клеток в модели повреждения и восстановления кишечника обеспечивает более физиологически переводимую модель in vitro по сравнению с существующими моделями, использующими традиционные колоректальные монослои18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Желудочно-кишечный тракт недоношенного ребенка находится под постоянным регенеративным давлением от повторного воздействия экологических оскорблений, связанных с дисбактериозом, воспалительными бактериальными метаболитами и токсинами и прерывистой гипоксией23,24</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот контент является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. HC поддерживается грантом P20GM134973 от Национальных институтов здравоохранения. KB поддерживается грантом Фонда детских больниц (CHF) и Фонда пресвитерианского здравоохранения (PHF). Услуги визуализации живых клеток, предоставляемые ядром функциональной геномики рака, были частично поддержаны грантом Национального института общих медицинских наук P20GM103639 и грантом Национального института рака P30CA225520 Национальных институтов здравоохранения, присужденным Онкологическому центру Стивенсона Университета Оклахомы.
Materials
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
References
- Lemons, J. A., et al. Very low birth weight outcomes of the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network, January 1995 through December 1996. Pediatrics. 107 (1), 1 (2001).
- Burge, K., Vieira, F., Eckert, J., Chaaban, H. Lipid composition, digestion, and absorption differences among neonatal feeding strategies: Potential implications for intestinal inflammation in preterm infants. Nutrients. 13 (2), 550 (2021).
- Duffy, L. C. Interactions mediating bacterial translocation in the immature intestine. The Journal of Nutrition. 130, 432-436 (2000).
- Nanthakumar, N., et al. The mechanism of excessive intestinal inflammation in necrotizing enterocolitis: An immature innate immune response. PLoS One. 6 (3), 17776 (2011).
- Nanthakumar, N. N., Fusunyan, R. D., Sanderson, I., Walker, W. A. Inflammation in the developing human intestine: A possible pathophysiologic contribution to necrotizing enterocolitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 6043-6048 (2000).
- He, Y., Lawlor, N. T., Newburg, D. S. Human milk components modulate toll-like receptor-mediated inflammation. Advances in Nutrition. 7 (1), 102-111 (2016).
- Walker, W. A., Iyengar, R. S. Breast milk, microbiota, and intestinal immune homeostasis. Pediatric Research. 77 (1-2), 220-228 (2015).
- Westerbeek, E. A., vanden Berg, A., Lafeber, H. N., Fetter, W. P., van Elburg, R. M. The effect of enteral supplementation of a prebiotic mixture of non-human milk galacto-, fructo- and acidic oligosaccharides on intestinal permeability in preterm infants. British Journal of Nutrition. 105 (2), 268-274 (2011).
- vanden Berg, A., et al. The effect of glutamine-enriched enteral nutrition on intestinal permeability in very-low-birth-weight infants: A randomized controlled trial. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition. 30 (5), 408-414 (2006).
- Foster, J. P., Seth, R., Cole, M. J. Oral immunoglobulin for preventing necrotizing enterocolitis in preterm and low birth weight neonates. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 4 (4), (2016).
- Maffei, D., Schanler, R. J. Human milk is the feeding strategy to prevent necrotizing enterocolitis. Seminars in Perinatology. 41 (1), 36-40 (2017).
- Patel, A. L., Kim, J. H. Human milk and necrotizing enterocolitis. Seminars in Pediatric Surgery. 27 (1), 34-38 (2018).
- Nolan, L. S., Parks, O. B., Good, M. A review of the immunomodulating components of maternal breast milk and protection against necrotizing enterocolitis. Nutrients. 12 (1), 14 (2019).
- Hill, D. R., et al. Human milk hyaluronan enhances innate defense of the intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 288 (40), 29090-29104 (2013).
- Burge, K., Bergner, E., Gunasekaran, A., Eckert, J., Chaaban, H. The role of glycosaminoglycans in protection from neonatal necrotizing enterocolitis: A narrative review. Nutrients. 12 (2), 546 (2020).
- Chaaban, H., et al. Acceleration of small intestine development and remodeling of the microbiome following hyaluronan 35 kDa treatment in neonatal mice. Nutrients. 13 (6), 2030 (2021).
- Gunasekaran, A., et al. Hyaluronan 35 kDa enhances epithelial barrier function and protects against the development of murine necrotizing enterocolitis. Pediatric Research. 87 (7), 1177-1184 (2020).
- Montenegro-Miranda, P. S., et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4α as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 10 (2), 209-223 (2020).
- Lee, C., Hong, S. N., Kim, E. R., Chang, D. K., Kim, Y. H. Epithelial regeneration ability of Crohn’s disease assessed using patient-derived intestinal organoids. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 6013 (2021).
- Gurung, S., et al. Maternal Zika virus (ZIKV) infection following vaginal inoculation with ZIKV-infected semen in timed-pregnant olive baboons. Journal of Virology. 94 (11), 00058 (2020).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Kobelt, D., Walther, W., Stein, U. S. Real-time cell migration monitoring to analyze drug synergism in the scratch assay using the IncuCyte system. Methods in Molecular Biology. 2294, 133-142 (2021).
- de Jong, J. C. W., Ijssennagger, N., van Mil, S. W. C. Breast milk nutrients driving intestinal epithelial layer maturation via Wnt and Notch signaling: Implications for necrotizing enterocolitis. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1867 (11), 166229 (2021).
- Yu, Y., et al. Erythropoietin protects epithelial cells from excessive autophagy and apoptosis in experimental neonatal necrotizing enterocolitis. PLoS One. 8 (7), 69620 (2013).
- Kessler, S. P., et al. Multifunctional role of 35 kilodalton hyaluronan in promoting defense of the intestinal epithelium. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 66 (4), 273-287 (2018).
- Fraser, J. R. E., Laurent, T. C., Laurent, U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover. Journal of Internal Medicine. 242 (1), 27-33 (1997).
- Kim, Y., et al. Hyaluronan 35kDa treatment protects mice from Citrobacter rodentium infection and induces epithelial tight junction protein ZO-1 in vivo. Matrix Biology. 62, 28-39 (2017).
- Prehm, P., Schumacher, U. Inhibition of hyaluronan export from human fibroblasts by inhibitors of multidrug resistance transporters. Biochemical Pharmacology. 68 (7), 1401-1410 (2004).
- Stenson, W. F., Ciorba, M. A. Nonmicrobial activation of TLRs controls intestinal growth, wound repair, and radioprotection. Frontiers in Immunology. 11 (3591), 617510 (2021).
- Riehl, T. E., Ee, X., Stenson, W. F. Hyaluronic acid regulates normal intestinal and colonic growth in mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 303 (3), 377-388 (2012).
- Riehl, T. E., Santhanam, S., Foster, L., Ciorba, M., Stenson, W. F. CD44 and TLR4 mediate hyaluronic acid regulation of Lgr5+ stem cell proliferation, crypt fission, and intestinal growth in postnatal and adult mice. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 309 (11), 874-887 (2015).
- Hill, D. R., Kessler, S. P., Rho, H. K., Cowman, M. K., de la Motte, C. A. Specific-sized hyaluronan fragments promote expression of human beta-defensin 2 in intestinal epithelium. Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30610-30624 (2012).
- Fernando, E. H., Gordon, M. H., Beck, P. L., MacNaughton, W. K. Inhibition of intestinal epithelial wound healing through protease-activated receptor-2 activation in Caco2 cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (2), 382-392 (2018).
- Nyegaard, S., Christensen, B., Rasmussen, J. T. An optimized method for accurate quantification of cell migration using human small intestine cells. Metabolic Engineering Communications. 3, 76-83 (2016).
- Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272 (2020).
- Singh, A., Poling, H. M., Spence, J. R., Wells, J. M., Helmrath, M. A. Gastrointestinal organoids: a next-generation tool for modeling human development. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 319 (3), 375-381 (2020).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology. Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).
